3種植物提取物對梨葉黑斑病菌抑制作用研究

高小寬 張眉

摘 要：以梨黑斑病原菌（Alternaria kikuchiana Tanaka）為供試菌株，采用離體葉盤法、菌絲生長速率測定法和病原孢子萌發率方法，研究了三七、五味子和銀杏3種提取物不同濃度對梨葉黑斑病原菌的抗菌活性。結果表明：3種植物提取物在不同的浸泡時間隨著處理液濃度的增加抑制率呈現先升高后降低的趨勢，3種植物提取物對梨葉黑斑病菌的最佳抑制濃度均為2 000 mg/L，三七提取物對梨葉黑斑病抑菌浸泡時間最佳是2 h，而五味子、銀杏提取物浸泡時間則為3 h。三七提取物對梨葉黑斑病抑菌效果最好。

關鍵詞：梨黑斑病;植物提取物;離體葉盤法

文章編號：2096-8108（2021）03-0019-05? 中圖分類號：S436.612.1+4? 文獻標識碼：A

Study on the Inhibitory Effect of Three Kinds Plants Extracts on Pear Leaf Black Spot

GAO Xiaokuan，ZHANG Mei

（Department of Biology， Hengshui College， Hengshui 053000， China）

Abstract：Taking the pathogen of pear black spot （Alternaria kikuchiana Tanaka） as the trial bacterial strain， using the methods of leaf disc in vitro test， hypha growth ratio test and the pathogen spore germination ratio test， the inhibitory effect of the extracts with different density from panax notoginseng， schisandra and ginkgo biloba was studied. The results showed that the inhibitory effect of the three kinds plants extracts increased first and then decreased with the increase of the concentration of the solution in different soaking time. The optimum inhibitory concentration of the three kinds plants extracts on Pear leaf black spot pathogen was 2 000 mg/L. The optimum soaking time of Panax notoginseng extract for the inhibitory effect on pear leaf black spot was 2 h， while the optimum soaking time of schisandra and ginkgo extracts was 3 h. Panax notoginseng extract had the best antibacterial effect on pear leaf black spot.

Keywords：Pear Leaf Black Spot; plants extracts; leaf disc in vitro test

黑斑病是影響我國梨產量及質量的主要病害之一，鏈格孢菌是導致梨感染黑斑病的主要病菌[1]。梨樹早期落葉和嫩梢枯死都可能是梨黑斑病菌的出現導致的，而且梨黑斑病的出現會讓果實提前掉落并且伴隨著裂果現象，嚴重削弱樹的生長，降低樹體的生命力和抗病能力[2]。該病的潛伏侵染期在梨樹的花期和幼果期，在果實的貯藏期間梨黑斑病仍存在并且不易控制和防范[3]。

防治梨黑斑病的方法很多，但目前仍以化學防治為主，但是化學殺菌劑的使用已超過數10年，其使用量已經達到最初量的數倍，這表明病菌的抗藥性正在增強[4]，如果再繼續使用則會導致病菌的增長難以控制，而且污染自然環境，其次人們的身體健康狀況會受到殘留在果實上的化學藥劑的威脅 [5]。

因此迫切需要篩選出生防活性高和對環境安全的新型防治藥劑。

我國中草藥資源較豐富，含有抗菌、抑菌、殺蟲作用的成分，這些成分是自然存在的，一般易于降解，對環境積蓄毒性的可能性不大[6]，本實驗用五味子、三七、銀杏提取物開展對梨葉期的梨黑斑病菌抑制試驗。

高小寬等研究發現五味子、三七、銀杏提取物對貯藏期梨黑斑病的防治有明顯效果[7]。梁魁景等通過實驗得到三七提取物對梨黑斑病的菌絲生長有一定的抑制效果[8]，但是利用植物提取物對梨樹葉片期進行梨黑斑病防治的方法很少，因此進行五味子等提取物對梨葉片黑斑病的抑制研究很有必要。

本試驗通過植物提取物對梨葉片黑斑病病菌進行抑制效果研究，采用離體葉盤法測定五味子、三七、銀杏葉3種提取物對梨黑斑病菌的抑制效果，從而篩選出五味子等提取物對梨葉片黑斑病抑制的最佳濃度及梨葉片最佳浸液時間，以此為防治梨葉片黑斑病提供數據基礎，并為新型生物防治劑的開發提供理論依據。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料制備

1.1.1 病原菌制備

采集患有梨黑斑病的病葉，用70%酒精進行表面擦拭消毒，無菌水沖洗后切取病健交界處組織，在無菌操作條件下移置到PDA平板上，于25 ℃保溫培養，表面長出分生孢子后進行單孢分離，純化后在PDA培養基上作為供試菌株在冰箱中保存待用。

1.1.2 3種植物粗提取

分別對五味子、三七、銀杏葉進行粉碎，用80%乙醇進行提取，在搖床中以150? rpm，25 ℃振蕩2 d，用離心機以3 500 r/min離心20 min，離心結束后取上清液進行旋轉蒸發，最后用80%乙醇定容，最后將定容好的提取物容器進行編號，放入4 ℃冰箱中保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 PDA培養基的制備

采用方中達方法[9]，首先用天平稱量去皮的馬鈴薯200 g，將其切成小方形塊，放入鍋中，加無菌水1 000 mL，煮沸30 min。將紗布對折用于濾去馬鈴薯殘渣，將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂15～20 g，邊加邊攪拌防止糊化，將瓊脂加熱熔化后加入葡萄糖20 g。待葡萄糖溶解后，加入適量的無菌水以補充加熱過程中損失的水分，定容至1 000 mL。分裝至250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，包裝完成后，在0.103 Mpa，121 ℃下，高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.2 病原菌的擴大化培養

取實驗室冰箱保存菌種，在超凈工作臺下進行菌種的擴大培養。首先利用滅菌的打孔器在保存的菌板約2/3直徑處鉆取菌餅，將鉆取的菌餅用接種針轉移到PDA平板中心處，菌面朝下，置于光照培養箱中25 ℃培養。培養期間要定時觀察，將有雜菌感染的平板處理，當梨黑斑病菌菌落直徑接近2/3培養皿直徑時，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.3 離體抑菌試驗

首先配制所需濃度溶液，即配置五味子、三七、銀杏葉子提取物質量濃度分別為50、100、250、500、1 000、1 500、2 000、4 000 mg/L的溶液，將配置完成的五味子、三七、銀杏葉提取物溶液放置于4 ℃冰箱中保存備用。采用離體葉盤法測定梨黑斑病菌對五味子、三七、銀杏葉提取物的敏感性。從衡水學院校園采集葉齡相同的梨健康葉片，用自來水沖洗晾干，葉片正面朝上浸泡于上述不同處理藥液及對照組中。

每種處理液及對照按照0.5、1、2、3、4 h的不同時間浸泡。然后將葉盤上的藥液用吸水紙吸干，葉背面朝上置于底部墊有用相同藥液潤濕的托盤內。每個葉盤上接種2個菌餅，每次處理3次重復。最后把托盤用保鮮膜罩好，保持濕潤狀態。設置對照。培養7 d觀察結果。菌落生長直徑采用十字交叉法測量，根據測量數據進行抑制率的計算。

1.2.4 離體抑菌試驗數據處理

菌絲生長抑制率=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）]×100%

用十字交叉法測量藥液處理后菌斑直徑和對照組菌斑直徑。將試驗數據輸入Excel表格，計算出不同濃度藥液及時間下的抑制率，并應用SPSS15.0 統計軟件求出藥劑毒力回歸方程和EC50值。

1.3 發病情況調查

接種7 d 后，根據葉盤發病面積，采用9級法記錄病情。0級，無病斑;1級，病斑面積占整個葉片面積的5%以下;3 級，病斑面積占整個葉片面積的5.1%～25.0%;5級，病斑面積占整個葉片面積的25.1%～50.0%;7級，病斑面積占整個葉片面積的50.1%～75.0%;9級，病斑面積占整個葉片面積的75.1%以上。根據下式計算各處理的病情指數。

病情指數=Σ（各級發病葉盤數×相對極值）/（調查總葉盤數×9）

防治效果=[1-（處理葉盤病情指數/對照葉盤病情指數）]×100%

2 結果分析

2.1 3種植物提取物不同濃度及時間對梨葉黑斑病菌菌絲生長的影響

3種植物提取物在不同濃度及不同浸泡時間對梨葉黑斑病菌的影響見表1所示，梨葉片浸液0.5 h時，3種植物提取物在濃度為50 mg/L時抑制率均較低，其中銀杏提取物的抑制率最低，為6.15，幾乎沒有抑制效果。隨著3種植物提取物濃度的增加，抑制率隨之升高，但是在各個濃度梯度之間，抑制率差異不顯著。當濃度為2 000 mg/L時，3種植物提取物抑制效果均達到最高，但當濃度為4 000 mg/L時，抑制率卻降低。在其他浸泡時間，葉片在各個濃度梯度下的變化規律與0.5 h相似。三七提取物的濃度為2 000 mg/L，葉片浸泡時間為2 h時，抑制率達到最高值，為55.42%，并且隨著浸泡時間的延長，抑制率降低。而五味子和銀杏提取物的濃度在2 000 mg/L時，葉片浸泡時間達到3 h時，抑制率達到最高值，分別為49.04%和47.76%。另觀測到，在同樣濃度下，葉片浸液在4 h時，五味子提取物的抑菌效果降低，但差異不顯著，而銀杏提取物的抑菌效果顯著降低。

綜合以上分析，可知三七提取物對梨葉黑斑病抑菌效果最好，其次是五味子提取物，最差的是銀杏提取物。

2.2 藥液對梨黑斑病菌的室內毒力測定

EC50是藥物的安全性指標，即為半最大效應濃度，是指引起50%個體有效的藥物濃度。EC50

值越大，表示藥物越安全，數值越小代表藥劑毒力越強。不同濃度藥液及浸泡時間對梨葉黑斑病影響的相關毒力回歸方程及EC50值、相關系數見表2所示。由表可以看出，每個毒力回歸方程的相關系數均大于0.916 683 443，說明離體葉盤保濕法具有較高的精密度。3種植物提取物在梨葉浸液時間為0.5 h時抑菌效果均不明顯，五味子、銀杏提取物在梨葉片浸泡3 h時抑制作用均最好，毒力最強，EC50分別為3 482.454、3 585.842 mg/L，而三七提取物在梨葉片浸泡2 h時抑制作用最好，毒力最強，EC50值為1 597.225 291 mg/L。

此結果與3種植物提取物不同濃度及浸液時間對梨葉黑斑病菌菌絲生長的影響結果一致。

2.3 病情記錄

通過9級法記錄病情，在不同浸泡時間下各級發病葉盤數如表3所示，因黑斑病菌常常以小病斑相互聯合形成不規則大斑，所以單菌落病情級數最大為3級。在不同浸泡時間下，各級發病葉盤數也不同。

1級發病葉盤數在0.5～3 h隨著浸泡時間的延長而增加，如三七提取物浸泡梨葉時間為2 h時，發病葉盤數達到最大值，在3 h時保持不變; 而五味子、銀杏提取物在對梨葉浸液時間為3 h時，發病葉盤數均達到最大值，但在4 h時3種提取物的發病葉盤數開始下降，3級發病葉盤數卻與之相反。

2.4 病情指數及防治效果

由9級法得出的各級病斑，計算出各個時間段的處理葉盤病情指數及防治效果。如表4所示，葉片浸泡在對照組時，病情指數為33.33%，五味子提取物在對梨葉片浸泡3 h時病情指數為最小值18.51%，較對照的病情指數下降了14.82個百分點，并且防治效果最好達到了44.4%，由此可看出梨葉片浸液時間為3 h時對梨葉期的梨黑斑病防治效果達到最佳。銀杏提取物在梨葉浸泡間達到3 h時，發病指數亦達到最低，值為22.22%，其防治效果達到最大值為33.33%。三七提取物在梨葉片浸泡0.5 h時病情指數最高，為26.85%，在2? h，3? h時葉片病情指數最低，為14.81%。從防治效果來看，在0.5～1 h的葉片發病率最重，防治效果小于50%;浸泡2 h、3 h時，防治效果最佳，為55.56%。

3 結論

3種提取物對梨葉黑斑病在不同濃度及不同浸泡時間下均有不同程度的抑菌效果。并且發現3種植物濃度在2 000 mg/L時均達到最好的抑菌效果。但是最佳浸泡時間卻不同，三七提取物對梨葉浸泡最佳時間是2 h，而五味子、銀杏提取物對梨葉浸泡時間卻為3 h。綜上所述，三七提取物對梨葉黑斑病抑菌效果最好，其次是五味子提取物，最差的是銀杏提取物。這一結果與高小寬等[7]關于3種植物提取物對貯藏期梨黑斑病的防治研究結果一致。

本試驗通過室內實驗測定梨黑斑病菌對五味子、三七、銀杏提取物的敏感性，初步確定了梨葉片最佳浸液時間及最佳藥劑濃度。

本次試驗僅是對五味子、三七、銀杏3種植物提取物在防治梨黑斑病方面提供數據基礎，并為新型生物防治劑的開發提供理論依據。由于室內實驗受到多種因素的影響，實際抑制效果還要依賴于室外環境來進行試驗，還需進一步研究。

參考文獻

[1]劉杏訪，劉金哲，鄭麗錦.梨樹常見病蟲害的發生與防治[J].河北林業科技，2013（1）：70-72.

[2]孫 勇，魏 來.梨樹黑斑病的特點及防治[J].農業與技術，2013（11）：147.

[3]何漢祚，張秀葉，郭樹凡，等.梨黑斑病的發生規律與防治技術[J].山西果樹，1995（4）：28-29.

[4]胡紅菊，王友平，張靖國，等.梨黑斑病病原菌的生物學特性及其致病性觀察[J].華中農業大學學報，2009，28（6）：680-684.

[5]程年拂，葉生海，王成玉.梨黑斑病發生持點及綜合防治技術[J].湖北植保，2003（3）：9.

[6]段勁生，王 梅，胡本進.中草藥源殺菌劑的研究進展[J].安徽農業科學，2007（3）：775-778.

[7]高小寬，梁魁景，張志強，等.3種植物提取物對梨儲藏期黑斑病菌抑制作用[J].北方園藝，2018（20）：161-165.

[8]高小寬，劉亞軒，梁魁景.五味子提取物對貯藏期梨黑斑病的防治研究[J].河北果樹，2017（5）：11-13.

[9]方中達.植病研究方法[M].北京：中國農業出版社（第三版），1998：25-27.

收稿日期：2021-01-15

基金項目：衡水市科技計劃研究資助項目（2019014025Z）;衡水學院自然科學類項目（編號：2020ZR20）

第一作者簡介：高小寬（1981-），女，農學碩士，講師，主要從事植物保護的研究。

E-mail：507105863@qq.com