甲氟奎對食管鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機制

李靜，劉芳

作者單位：棗莊礦業集團中心醫院腫瘤內科，山東 棗莊 277000

食管鱗癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其占食管癌的 90% 以上，其特征是脂肪和骨骼肌質量減少、營養不良。據最新調查顯示，食管鱗癌的發病率正逐年升高，盡管近期食管癌 的預后有所改善，但仍不能令人滿意。因此，開發新的抗癌藥物對病人具有重要的治療價值。甲氟喹是氯喹的衍生物，是治療瘧疾的常用藥物之一。甲氟奎在膠質母細胞瘤、乳腺癌中均具有抑制腫瘤進一步惡化的作用，甲氟喹的主要優點是其具有良好的劑量耐受性。于是，我們推測其對食管鱗癌的治療可能也具有一定的療效。β 連環素（β-catenin）是 Wnt通路中的關鍵核心因子，也是 β-catenin 信號通路的組成部分，其在人類的多種疾病，包括食管鱗癌中均出現活性異常升高，但其是否在甲氟奎對食管鱗癌的影響中發揮作用尚未清楚 。 本研究于2018年8月至2019年4月擬以食管鱗癌細胞KYSE140為研究對象，觀察甲氟奎對食管鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，揭示其機制與甲氟奎失活 β-catenin 信號通路有關，將為甲氟奎抗癌應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

食管鱗癌細胞 KYSE140 購自 ATCC；甲氟奎由 Unistin?韓國聯合制藥提供 ；DMEM 培養基、胎牛血清、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、胰蛋白酶均購自美國 Sellect 公司；Lipofectamine2000、BCA 蛋白定量試劑盒、逆轉錄試劑盒購自大連 Takara 公司 ；聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）購自德國羅氏診斷有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒、ECL 發光液和 RIPA 蛋白裂解液均購自碧云天生物技術公司；Matrigel 基質膠、Transwell 小室購自美國Coming 公司；凝膠成像分析儀購自柯達公司；半干轉膜儀購自美國 BIO-RAD 公司；Genesys 10 紫外分光光度計購自美國 Thermo 公司；細胞培養箱購自美國 Forma Scientific 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將食管鱗癌細胞 KYSE140 用含10% 胎牛血清的 DMEM 培養基，置于 37 ℃，5% 二氧化碳的恒溫培養箱中常規培養，待細胞生長至融合度 75% 左右，用胰蛋白酶消化約 1 min，按照 1∶3 的比例更換培養基，每 2 天傳代 1 次。

1.2.2 細胞處理與分組 將甲氟奎（5、10、15、30 μmol∕L）用二甲基亞砜（DMSO）溶解然后用培養基稀釋為 5、10、15、30 μmol∕L，分別處理 KYSE140 細胞 24、48 、72 h，標記為 5 μmol∕L 甲氟奎組、10 μmol∕L 甲氟奎組、15 μmol∕L 甲氟奎組、30 μmol∕L 甲氟奎組，篩選最適濃度和作用時間，即 15 μmol∕L 甲氟奎處理 KYSE140 細胞 48 h，標記為甲氟奎組；以 DMSO處理 KYSE140 細胞 48 h，標記為對照組 ；將 β -catenin 信號通路激活劑 Wnt3a 用 DMSO 稀釋至 25 mg∕L，處理甲氟奎組細胞 24 h，標記為甲氟奎 +Wnt3a 組，其陰性對照用等量的 DMSO 處理甲氟奎組細胞 24 h，標記為甲氟奎+DMSO 組。

1.2.3 MTT 法檢測細胞增殖抑制率對數期的KYSE140 細胞以 10∕mL 的密度種植于 96 孔板，按照上述“1.2.2”方法處理，分別于 24、48 和 72 h 時每孔細胞中加濃度為 5 mg∕mL MTT 溶液 20 μL，孵育 4 h，然后添加 150 μL DMSO，待結晶充分融解，在 490 nm 波長下檢測細胞吸光度（A）。細胞抑制率=（1-A∕A）×100%。

1.2.4 Transwell 法檢測細胞遷移和侵襲 Transwell遷移實驗：將 Transwell 小室置于 24 孔板上，平衡 30 min。胰酶消化收集各組 KYSE140 細胞，用不含血清的 RPMI 1640 培養基重懸細胞，制成 5×10∕mL 的單細胞懸液。取約為 1×10個細胞加入 24 孔板各孔，于 37 ℃培養箱孵育 24 h，棉簽擦去上室細胞，甲醇固定，結晶紫染液染色。晾干，于倒置顯微鏡下觀察拍照（400 倍），計數 5 個不同視野細胞數。

Transwell 侵襲實驗：將基質膠和 DMEM 培養基按 1∶8 稀釋后（60 μL）鋪于培養小室上，風干后備用，其他步驟同 Transwell 遷移實驗。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測細胞中 β-catenin、周期素依賴激酶抑制劑 p21、增殖細胞核抗原（PCNA）、神經鈣黏素（N-cadherin）、上皮鈣黏素（E-cadherin）的蛋白表達 各組 KYSE140 細胞以 RIPA 裂解液于冰上裂解提取總蛋白，BCA 法對蛋白定量。并采用沸水浴致蛋白變性，目的蛋白采用 SDS-PAGE 電泳分離。濕轉至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉 1 h，4 ℃下，將封閉后的 PVDF 膜放入倍比稀釋的一抗中反應過夜，洗膜，再在 37 ℃下將 PVDF 膜轉入倍比稀釋的二抗中反應 2 h。于暗室內 ECL 試劑盒顯影曝光，以凝膠成像系統采集圖像。Quantity One 4.62 圖像分析軟件進行條帶灰度分析，以 GAPDH 為內參，計算目的蛋白的表達情況。

1.2.6 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反 應（qRTPCR）檢測細胞中 β-catenin 的表達 各組 KYSE140細胞按 RNA 抽提試劑盒說明書提取 RNA，定量后使用逆轉錄 試 劑盒合 成 互補 DNA（cDNA）。按 qRTPCR 試劑盒說明書操作檢測 miR-550a 表達量。以甘油醛 -3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，用 ΔΔCt=(Ct－Ct)－ (Ct－Ct)計算 β-catenin的表達 。 引物信息 ：β -catenin，正向引物 5'-CGCTTCTCGGCTTGCT-3′，反向引物 5'-TCCTCCCTCACAGACTCAT-3′；GAPDH，正向引物 5'-TCCCTCAAGATTGCTAGCAA-3 ′，反向引物 5'-AGATCCACAACGGATACATT-3'。

2 結果

2.1 甲氟奎對食管鱗癌細胞的抑制作用

結果如表1 所示，與對照組相比，5 μmol∕L 甲氟奎組 、10 μmol∕L 甲氟奎組、15 μmol∕L 甲氟奎組、30 μmol∕L 甲氟奎組細胞的增殖均顯著降低；與 5 μmol∕L 甲氟奎組相比，10 μmol∕L 甲氟奎組、15 μmol∕L 甲氟奎組、30 μmol∕L 甲氟奎組細胞的增殖均顯著降低；與 10 μmol∕L 甲氟奎組相比 ，15 μmol∕L 甲氟奎組 、30 μmol∕L 甲氟奎組細胞的增殖均顯著降低（

P

＜0.05）。可見，甲氟奎可呈濃度依賴性抑制食管鱗癌細胞的增殖，且最適濃度為 15 μmol∕L，故選用該濃度用于后續試驗。

表1 甲氟奎對食管鱗癌細胞增殖的影響

2.2 甲氟奎對食管鱗癌細胞遷移和侵襲的抑制作用

Transwell 實驗檢測細胞遷移和侵襲，對照組遷移 和 侵襲細 胞 數分別為（120±8）個、（80±6）個，甲氟奎組遷移和侵襲細胞數分別為（62±5）個、（45±4）個，與對照組相比，甲氟奎組細胞的遷移細胞數顯著降低，侵襲細胞數顯著降低（

t

=15.059、11.889，

P

＜0.05）。

2.3 甲氟奎對食管鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白表達的影響

結果如圖1 和表2 所示，與對照組相比 ，甲氟奎組細胞中 p21、E-cadherin 蛋白表達顯著升高，PCNA、N-cadherin 蛋白表達顯著降低（

P

＜0.05）。

2.4 甲氟奎對食管鱗癌細胞中 β-catenin 信號通路的影響

qRT-PCR 法檢測細胞中 β-catenin 的表達，結果如圖2 所示，對照組 β-catenin mRNA 和蛋白表達水平分別為（1.00±0.04）、（1.01±0.07），甲氟奎組β -catenin mRNA 和蛋白表達水平分別為（0.51±0.05）、（0.34±0.03），與對照組相比，甲氟奎組細胞中β -catenin 的 mRNA 和蛋白表達均顯著降低（

t

=18.745、21.550，

P

＜0.05）。

2.5 激活 β-catenin 信號通路逆轉了甲氟奎對食管鱗癌細胞增殖、遷移、侵襲的調控

結果如圖3、表3，表4 所示 ，與甲氟奎 +DMSO 組 相比 ，甲氟奎 +Wnt3a 組細胞中 β-catenin 蛋白表達顯著升高，細胞的增殖顯著升高，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著升高 ，細胞中 p21、E-cadherin 蛋白表達顯著降低 ，PCNA、N-cadherin 蛋白表達顯著升高（

P

＜0.05）。

圖1 甲氟奎處理的食管鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白表達

表2 甲氟奎對食管鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白表達的影響

圖2 甲氟奎處理的食管鱗癌細胞中 β-catenin 信號通路關鍵蛋白的表達

圖3 食管癌細胞中的 β-catenin 信號通路增殖、遷移和侵襲相關蛋白表達

表3 甲氟奎對食管鱗癌細胞增殖的影響∕

3 討論

盡管醫學技術不斷發展，食管鱗癌的發病率和病死率仍然很高，因此，尋找高效、低毒的腫瘤治療藥物仍然十分重要。甲氟奎在臨床上對耐氯奎惡性瘧疾的治療效果較好，除此之外其在人類的多種腫瘤中也具有抗癌的功效，但是其在食管鱗癌中的功能及機制研究甚少。Xu 等研究報道，甲氟奎可通過阻斷結直腸癌細胞中 NF-κB 信號傳導抑制結直腸癌細胞的生長，促進其凋亡，這說明抗瘧疾藥甲氟奎可單獨作為抗癌藥在結直腸癌中應用。Xie 等在食管鱗癌的研究中發現，甲氟奎處理食管鱗癌后，線粒體呼吸鏈中的必需酶 SDHC、SDHD、MTCO3 和 NDUFV3 的表達均顯著下調，并通過電鏡觀察到細胞發生自噬，揭示甲氟奎可通過誘導線粒體發生自噬來抑制食管鱗癌細胞的增殖和異種移植小鼠體內腫瘤的生長。本研究通過 MTT 法、Transwell 小室檢測了甲氟奎處理的食管鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲發現，甲氟奎可抑制食管鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其在食管鱗癌中發揮抑制癌癥進一步惡化的作用，這與 Xie 的研究結果相呼應，再次驗證了甲氟奎的抑癌功能，為甲氟奎在癌癥中的應用提供理論依據。我們又通過 qRT-PCR 法、蛋白質印跡法檢測了甲氟奎處理的食管鱗癌細胞中β-catenin 信號通路關鍵因子 β-catenin 的表達發現，甲氟奎可明顯的抑制食管鱗癌細胞中 β-catenin 的表達，失活 β-catenin 信號通路的活性。Li 等在肝癌的研究中報道，甲氟奎可抑制小鼠體內肝腫瘤的生長，其機制與抑制 β-catenin 信號通路的活性相關。我們推測甲氟奎在食管鱗癌中的功能可能與β -catenin 信號通路的活化程度也具有一定的相關性。

表4 激活 β-catenin 信號通路對甲氟奎調控食管鱗癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響∕

β-catenin 信號通路涉及腫瘤的免疫逃避、免疫抑制、免疫監視。 Wnt 信號傳導過程中最重要的是 β-catenin 的穩定，導致其核轉位和轉錄因子的激活。大部分腫瘤在 Wnt ∕β-catenin 信號通路的關鍵調節因子中發生突變。大量研究證實，β-catenin信號通路在食管癌的惡性化進展中具有重要 作用。本研究檢測了甲氟奎處理的食管鱗癌細胞中 β-catenin 的表達發現，甲氟奎可抑制食管鱗癌細胞中 β-catenin 信號通路的活性，這說明甲氟奎可抑制 β-catenin 信號通路的活性在食管鱗癌中發揮抗癌功能；進一步研究通過 β-catenin 信號通路激活劑和 甲氟奎聯合處理食管鱗癌細胞發現 ，激活 β -catenin 信號通路可逆轉甲氟奎對食管鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲抑制作用，這更充分的說明不僅甲氟奎可抑制 β-catenin 信號通路的活性，相反，激活 β-catenin 信號通路也可逆轉甲氟奎對食管鱗癌的抗癌功能。這些實驗結果為甲氟奎在食管鱗癌的治療中的應用價值提供了充分的理論參考，不足的是，我們沒有在動物體內對甲氟奎的功能機制進行驗證，這也是本課題下一步的研究計劃。

綜上所述，甲氟奎可抑制食管鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其機制與失活 β-catenin 信號通路密切相關，為甲氟奎作為抗癌藥物治療食管鱗癌提供理論參考。