吉非替尼通過調控表皮生長因子受體影響兔膝骨關節炎軟骨損傷作用的機制

謝大偉 ，張來鑫 ，李青松 ，王靜 ，王彤

作者單位：1 秦皇島市中醫醫院手足外科，河北 秦皇島 066000；2 青龍縣醫院婦產科，河北 秦皇島 066500

骨性關節炎（Osteoarthritis，OA）主要的病理改變表現為關節軟骨缺損及軟骨下骨質增生。目前OA 的發病機制依然不夠清楚，但氧化應激、炎癥因子、維生素 D、肥胖等因素都被證明是 OA 的危險因素，其中炎性因子誘發的軟骨細胞外基質的過度降解和軟骨退化被認為是 OA 的主要因素。表皮生長因子受體（EGFR）信號通路在機體的很多生長及代謝過程都發揮著重要的調控作用，尤其是在骨骼系統中調控軟骨細胞增殖、分化、凋亡等過程中的作用。吉非替尼作為一種選擇性 EGFR 酪氨酸激酶抑制劑，通過選擇性競爭 EGFR 酪氨酸激酶催化區域中的 Mg-ATP 結合位點，從而阻斷 EGFR 信號通路，抑制非小細胞肺癌的血管生成，促進細胞凋亡，但其在關節炎的作用目前鮮少報道。本研究于 2019年 1—6月在研究吉非替尼調控兔膝 OA 模型軟骨代謝過程中，進一步明確 EGFR 調控軟骨細胞代謝的具體機制，來為 OA 的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇清潔級健康新西蘭兔 30 只，雌性各半，6月齡，體質量范圍為 2.0～2.5 kg，由上海市松江區實驗動物廠提供，許可證號：SCXK（滬）2017—0008，由福建中醫藥大學動物中心提供清潔級飼養環境進行常規飼養 ，許可證號 SCXK（閩）2017-0001。動物實驗獲得秦皇島市中醫醫院動物研究倫理委員會批準（20190513）。根據《關于善待實驗動物的指導性意見》中動物處理方式進行實驗。

1.2 主要試劑及儀器

吉非替尼（山東安弘制藥有限公司提供 ，批號 H20160013，批次 20161223）；原位末端標記法（TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay，TUNEL）檢測試劑盒（上海銳聰科技發展有限公司）；Ⅱ型膠原蛋白（COL-Ⅱ）、基質金屬蛋白酶 13（MMP-13）免疫組化試劑盒（武漢博士德生物制劑有限公司）；腫瘤壞死因子 α（TNF-α），白細胞介素-1β（IL-1β）試劑盒（上海高創化學科技有限公司）；磷酸化絲裂素活化蛋白激酶（p-P38 MAPK）、絲裂素活化蛋白激酶（P38MAPK）、p-EGFR、EGFR、GAPDH 多克隆抗體（美國 Abcam 公司）；高速臺式冷凍離心機（德國 sigma3-30K）；OLYMPUSBX 51 顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）；HPIAS-1000 高清晰彩色病理圖 像 分 析系統（同濟千屏）。

1.3 動物分組及模型制備

將 30 只 6月齡新西蘭兔采用隨機數表法分為假手術組、模型組、吉非替尼組，每組 10 只。所有組均根據 Hulth-Telhag 法建立 OA 模型，利用 30 mg∕kg 戊巴比妥鈉與兔耳緣靜脈注射麻醉后，將兔保持仰臥位固定后，常規備皮，消毒鋪巾，取兔左、右膝關節內側行縱側剪開長約 4 cm 的切口，假手術組僅剪開皮膚，不做任何處理，模型組及吉非替尼組均剪斷前、后交叉韌帶及內側副韌帶，并將內側半月板完整的摘除，傷口縫合，采取無敷料包扎，不對傷腿進行固定。術后采用單兔單籠喂養方式，前 7 d 通過肌內注射硫酸慶大霉素 80000 U 防止傷口感染，每天強迫兔活動 30 min，4周后即可獲得兔 KOA 模型。

1.4 給藥方法

造模 4周后開始給藥，根據兔與人用藥量用 Meeh Rubner 公式換算等效劑量，吉非替尼組兔給予 85 mg∕kg 灌胃給藥，假手術組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，1 次∕天，連續 5周。

1.5 樣本采集及制備

停藥 1周后，于取樣前禁食10 h，耳緣靜脈注射空氣處死動物后，在髕骨內側做縱行切口，逐層分開直至關節囊，將關節處反復屈伸將關節液擠壓帶髕上囊內側后，往里面注射生理鹽水反復抽吸后，將關節液盡量抽出后放置于試管中 ，低溫高速離心 15 min 后 ，留取上清 ，保存于-80 ℃超低溫冰箱中待測。同時剪開膝關節囊后，將股骨內踝關節軟骨迅速取出并修成 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的組織塊，經固定、脫鈣后，石蠟包埋，連續切成厚約 5 μm 的切片，用于病理變化檢查及 TUNEL 細胞凋亡檢測。

1.6 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察軟骨組織病理變化情況及 Mankin ′s 評分

將組織切片用二甲苯溶液浸泡 5 min，浸泡 2 次；后梯度乙醇水合，然后依次浸入蘇木素染液內染色 3～5 min，水洗 30～60 s；酸水浸潤 20 s，水洗 30～60 s；氨水中浸潤 40 s，水洗 30～60 s；最后置于伊紅染液中染色 2 min，再洗去多余染液，濾紙吸干，迅速滴加適量中性樹膠，蓋玻片封固，顯微鏡下觀察染色情況并分析。以 Mankin ′s 評分評定標準，對各組軟骨組織 HE 染色病理變化情況進行分析。

1.7 TUNEL 染色觀察軟骨細胞凋亡情況

按照試劑盒說明要求，依次使用二甲苯和濃度梯度乙醇溶液清洗切片，用蛋白酶 K 溶液室溫處理 15 min，PBS清洗 4 次。10% 中性甲醛固定兩次，分別用乙醇乙酸和 3% 過氧化氫浸潤，PBS 清洗后加入 TdT 酶緩沖溶液孵育 5 min；PBS 清洗后加入預熱的終止液，終止反應 20 min，PBS 清洗 2 次，滴加過氧化酶標記物抗體，孵育 20 min 后 PBS 清洗，加上二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色液，顯色半小時用無水乙醇和二甲苯固定，晾干，熒光封片試劑封片。兩小時內熒光顯微鏡下觀察結果。凋亡率（%）=陽性細胞∕總細胞×100%。

1.8 關節液中 TNF-α、IL-1β 水平檢測

采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測關節液中 TNF-α、IL-1β水平，由專業熟練人員嚴重按照試劑盒說明說進行檢測。

1.9 免疫組化檢測軟骨組織中 COL-Ⅱ、MMP-13陽性表達情況

將石蠟切片脫水、PBS 溶液漂洗、3% 過氧化氫與甲醇混合液浸泡 10 min，超純水漂洗、抗原修復、PBS 漂洗 5 min、加入一抗 37 ℃反應 2 h、PBS 漂洗 5 min、加入二抗 37 ℃反應 40 min、PBS漂洗 5 min、DAB 室溫顯色 20～30 min，鏡檢觀察有棕黃色顆粒出現時則采用自來水終止。再用蘇木素復染 30 s、自來水漂洗、中性樹膠封片，光鏡下觀察細胞樣本中 COL-Ⅱ、MMP-13 的陽性表達細胞，其細胞質表現為棕黃色顆粒。每張片子 400×視野 10 個，統計陽性細胞數目，以計算陽性細胞率，陽性細胞率=陽性細胞數目∕總細胞計數×100%。

1.10 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測軟骨組織中 EGFR、P38MAPK 蛋白表達情況

提取各組兔軟骨組織中的總蛋白，采用 Bradford 調整各組蛋白濃度一致，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、電轉膜至甲醛處理過預處理過的聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜），密封 2 h，加入 p-P38MAPK、P38MAPK、p-EGFR、EGFR、GAPDH 一抗（1∶500）4 ℃孵育過夜，等滲緩沖鹽溶液（TBST）漂洗40 min，加入 HRP 標記的二抗（1∶500）孵育 1 h，TBST 漂洗 40 min，ECL 發光液顯色，暗室曝光到 X線片上，采用 Imaging System 軟件分析各組條帶灰度值，依據相對灰度值進行統計學分析。

2 結果

2.1 各組病理觀察及 Mankin′s 評分情況

與假手術組相比，模型組關節軟骨層明顯變薄，并且有潰裂和裂隙情況存在，同時軟骨柱狀排列消失，結構遭到嚴重損壞，軟骨細胞明顯減少，與模型組相比，吉非替尼組軟骨病理損傷情況更嚴重 ，且三組Mankin′s 評分關系為假手術組＜模型組＜吉非替尼組（均

P

＜0.05）。見圖1、表1。

2.2 各組軟骨細胞凋亡情況

TUNEL 染色結果顯示：假手術組軟骨細胞凋亡率顯著低于模型組，而模型組軟骨細胞凋亡率顯著低于吉非替尼組（均

P

＜0.05）。見表1。

2.3 各組關節液中 TNF-α、IL-1β 水平比較

假手術組兔關節液中 TNF-α、IL-1β 水平顯著低于模型組，而模型組兔關節液中 TNF-α、IL-1β 水平顯著低于吉非替尼組（均

P

＜0.05）。見表1。

2.4 各組中軟骨組織中 COL-Ⅱ、MMP-13 表達情況

免疫組化結果顯示：模型組中 COL-Ⅱ陽性表達率顯著低于假手術組，而又顯著高于吉非替尼組（

P

＜0.05），模型組中 MMP-13 陽性表達率顯著高于假手術組 ，而顯著低于吉非替尼組（

P

＜0.05）。見 圖2、表1。

圖1 各組新西蘭兔軟骨組織病理結果（HE染色×400） 圖2 各組新西蘭兔軟骨組織中Ⅱ型膠原蛋白（COL-Ⅱ）、基質金屬蛋白酶13（MMP-13）表達情況（免疫組織化學染色×400）

2.5 各組中 P38MAPK、EGFR 蛋白表達情況

Western blotting 結果顯示，吉非替尼組中 EGFR 蛋白磷酸化水平顯著低于模型組，模型組又顯著低于假手術組，同時吉非替尼組中 p38MAPK 蛋白磷酸化水平顯著高于模型組，模型組又顯著 高于假手術組（均

P

＜0.05）。見圖3、表1。

圖3 各組新西蘭兔中 P38MAPK、EGFR 蛋白表達條帶圖

3 討論

目前研究已經證實，軟骨細胞的凋亡、細胞外基質的降解都是導致 OA 軟骨降低的主要因素，而軟骨細胞的凋亡又發揮著關鍵的作用。關節軟骨作為一種特殊的無血管且細胞數目較少的結締組織，其軟骨細胞軟轉換率較低，因此軟骨損傷后的自我修復能力較差，而大量的動物實驗及臨床試驗結果顯示，要想提高軟骨組織自我修復能力維持軟骨組織的完整性至關重要。軟骨細胞的更新及代謝過程極為復雜，由多種細胞因子參與，其中 EGF 信號通路能夠介導多種信號傳導途徑，來調控軟骨細胞的生物學過程，在健康人群軟骨中可明顯看到磷酸化 EGFR 染色較強，且僅分布在軟骨表層，而隨著 OA 的進程，磷酸化 EGFR 的染色顯著減少。本研究發現給予兔 KOA 模型吉非替尼處理，關節軟骨損傷情況進一步惡化，提示磷酸化 EGFR水平減少后，會導致關節軟骨的結構、功能及機械力學等明顯減弱，加速軟骨病理條件下的退變。袁功武等利用遺傳修飾小鼠和吉非替尼處理小鼠，均發現低 EGFR 活性的 OA 小鼠軟骨細胞破壞加重，OA 進展更快，本研究與其基本一致。

細胞的凋亡是機體重要的自我保護機制，能夠避免細胞壞死后的內容物損傷周圍組織，而一旦這個機制出現問題，就會誘發炎癥。TNF-α 作為一種重要的炎癥細胞因子，能夠通過級聯效應加重炎癥反應，還會加速軟骨基質的降解，IL-1β 則是作為主要的效應因子，直接作用于軟骨細胞，促進前列腺素 E2 的釋放，誘發滑膜炎癥及骨吸收，同時前列腺素還會加速軟骨的分解，加重關節損傷。本研究結果顯示兔 KOA 模型吉非替尼處理后，軟骨細胞凋亡率顯著升高，同時關節液中 TNF-α、IL-1β 水平也顯著升高，提示我們吉非替尼可能是通過促進軟骨細胞凋亡及關節處炎癥反應來加重軟骨退變。陳永健等研究顯示，兔 KOA 模型軟骨細胞凋亡率顯著高于對照組，并且血清 TNF-α、IL-1β 水平也顯著高于對照組，本研究與其一致。

表1 各組新西蘭兔關節軟骨組織細胞各指標比較

軟骨基質的降解也是誘發 OA的重要因素 ，MMPs 蛋白通過特異性的裂解膠原分子，從而直接降解軟骨基質，其中 MMP-13 可直接降解軟骨基質中最具代表性且含量最高的 COL-Ⅱ，其他 MMPs 都需要經過 MMP-13 來發揮作用 ，因此 MMP-13 和COL-Ⅱ的水平可作為反映軟骨退化情況的重要指標。本研究結果顯示，兔 KOA 模型吉非替尼處理后，COL-Ⅱ陽性表達率顯著降低，而 MMP-13 表達率顯著升高，表明吉非替尼通過促進 MMP-13 表達，加速 COL-Ⅱ降解，從而加重軟骨損傷。有研究表示MMPs 的表達受多種信號通路調控，其中 p38MAPK發揮著關鍵的作用，同時 EGFR 信號途徑可以直接或間接的影響 MAPK 信號轉導通路，通過蛋白質印跡法檢測軟骨組織中 EGFR、p38MAPK 蛋白表達水平，我們發現吉非替尼處理后，EGFR 磷酸化水平顯著降低，而 p38MAPK 磷酸化水平顯著升高，提示我們 低 EGFR 磷酸化水平 ，可能誘導p38MAPK 磷酸化 ，進而激活下游信號因子MMP-13表達 ，加速COL-Ⅱ的進行性降解，證實了 Shu 等提出的 EGFR 可能作為 p38MAPK 信號通路的上游調節因子發揮作用。

綜上所述，吉非替尼作為一種特異性 EGFR 磷酸化抑制劑，可能通過抑制 EGFR 磷酸化，促進下游p38MAPK 磷酸化 ，誘導MMP-13合成增加 ，加速COL-Ⅱ降解，同時還會提高關節處炎癥細胞因子水平，加重炎癥反應，加速軟骨細胞凋亡。因此提高EGFR 磷酸化可以作為防治 OA 的一種新手段，但EGFR 具體的調控機制仍有待深入研究。