5-甲氧基色醇對(duì)急性髓細(xì)胞性白血病 U937 細(xì)胞增殖和遷移的影響及其機(jī)制研究

王婷，保紅云，陳波，李曉娜

作者單位：云南省第三人民醫(yī)院腎病血液科，云南 昆明 650000

急性髓細(xì)胞性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是成年人最常見的一種高度異質(zhì)性疾病，主要由染色體易位和參與造血增殖、分化的基因突變引起低分化髓細(xì)胞的積累而導(dǎo)致。長(zhǎng)期以來 ，AML 的治療方案局限于化療和造血干細(xì)胞移植。目前的高強(qiáng)度治療方法可使年輕 AML 病人的治愈率約為 40%，60歲以上的老年 AML 病人的持久緩解率可達(dá) 15%。然而，目前的 AML 治療存在諸多問題，如化療耐藥的發(fā)生、移植后復(fù)發(fā)等。因此，探索更有效的治療 AML 的藥物迫在眉睫。

5- 甲氧基色醇（5-Methoxytryptophol）是松科植物成熟松果體中提取的吲哚類化合物，是松果的有效成分之一 。 具有抗氧化 ，抗炎 ，腫瘤抑制等作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，5-甲氧基色醇通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的蛋白激酶（ERK）的磷酸化促進(jìn)了 ERK1∕2 通路的激活從而抑制破骨細(xì)胞形成、促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。然而，5-甲氧基色醇對(duì) AML 細(xì)胞的增殖和遷移能力的影響及其相關(guān)作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)從 2018年 1月至 2019年 7月，主要探討 5-甲氧基色醇對(duì) AML 細(xì)胞增殖和遷移方面生物學(xué)行為的影響，為 AML 的臨床治療提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及材料

AML U937 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó) ATCC細(xì)胞庫(kù)；5-甲氧基色醇購(gòu)自武漢 MCE 生物公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基 、10% 胎牛血清（FBS），購(gòu)自美國(guó)Gibco 生物公司 ；人膽囊收縮素∕縮膽囊素八肽（CCK-8）試劑，凋亡試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。BCA 定量試劑盒、SDS-PAGE 膠制膠試劑盒購(gòu)自索萊寶生物公司；兔多克隆磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇 3 激酶（p-PI3K）、Akt 激酶（AKT）和磷酸化 Akt 激酶（p-AKT）抗體、鼠單克隆甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、山羊抗兔和山羊抗鼠二抗均購(gòu)自武漢三鷹生物公司。5-甲氧基色醇用二甲基亞砜（DMSO）配制成 0.1 mol∕L 的母液放置于-20 ℃儲(chǔ)存，用時(shí)以含 10% 胎牛血清的1640 培養(yǎng)基稀釋成各個(gè)濃度的工作液使用。Novoexpress 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)艾森生物公司；全波段多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó) BioTek 公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó) Bio-red 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

AML U937 細(xì)胞用含有 10%FBS、1% 青霉素及 1% 鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于 5% 二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱中，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

AML U937 細(xì)胞以每孔 4 000 個(gè)鋪入到 96 孔板中，每組設(shè)置 5 個(gè)復(fù)孔。分別用 8、16、32、64 μmol∕L 濃度的 5-甲氧基色醇處理細(xì)胞，對(duì)照組則予以含有等體積 DMSO 的 1640 培養(yǎng)基，每孔100 μL 培養(yǎng)體系。分別在 48、72 h 后，加入 CCK-8液 10 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中避光孵育 2 h 后，用酶標(biāo)儀在 450 nm 處檢測(cè)吸光度，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937 細(xì)胞（1×10個(gè)∕毫升）接種于六孔板中，培養(yǎng) 24 h 后，分別加入 5-甲氧基色醇（8、16、32 μmol∕L）及含等體積 DMSO 作為對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，消化離心收集細(xì)胞，加入 2.5 μL 的碘化丙啶（PI）和 2.5 μL 的膜聯(lián)蛋白 V-異硫氰酸熒光素（Annex V-FITC），室溫避光反應(yīng) 30 min 后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

U937 以無血清培養(yǎng)基重懸，200 μL 含 2×10個(gè)細(xì)胞的懸液加入到 Transwell 上室中，再分別加入不同濃度 5-甲氧基色醇（8、16、32 μmol∕L），以加入等體積二甲基亞砜（DMSO）處理作為對(duì)照。Transwell 下室加入 700 μL 含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基。24 h 后，棄掉培養(yǎng)基，多聚甲醛固定后，結(jié)晶紫染色，每孔隨機(jī)選取 5個(gè)視野，于正置顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)每視野下的遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.6 生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 5-甲氧基色醇作用的蛋白靶點(diǎn)并進(jìn)行通路富集分析

從 PubChem Compound Search databas（https：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕pccompound）中下載 5-甲氧基色醇的 3D 結(jié)果文件，導(dǎo)入化合物 3D 結(jié)構(gòu)文件使用在線預(yù)測(cè)化合物作用的蛋白靶點(diǎn)的網(wǎng)站 SwissTargetPrediction（http：∕∕www.swisstargetprediction.ch∕），解析出化合物的藥效團(tuán)，并基于藥效團(tuán)模型預(yù)測(cè)從而獲得 5-甲氧基色醇作用的蛋白靶點(diǎn)。并將預(yù)測(cè)得到的靶點(diǎn)蛋白應(yīng)用在線數(shù)據(jù) 庫(kù) DAVID（https：∕∕david.ncifcrf.gov∕）進(jìn)行通路富集分析。設(shè)置

P

＜0.05 為判斷通路顯著性富集的標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) PI3K、p-PI3K、AKT 和 p-AKT 的表達(dá)

BCA 定量后蛋白樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜后，用含 5% 的脫脂奶粉封閉 2 h，分別加入一抗（兔源性多克隆 PI3K、p-PI3K、AKT 和 p-AKT 抗體和鼠源性 GAPDH 內(nèi)參抗體）4 ℃過夜。TBST 洗滌 3 次后，加入二抗室溫孵育 2 h，曝光。以目的條帶與內(nèi)參 GAPDH 的灰度值的比值為目的蛋白的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

2 結(jié)果

2.1 5-甲氧基色醇明顯抑制 AML U937 細(xì)胞的增殖

CCK-8 結(jié)果顯示，8、16、32、64 μmol∕L 5-甲氧基色醇對(duì) U937 的增殖抑制率分別為 48 h：（17.4±1.2）%，（31.6±2.6）%，（43.5±3.2）%和（58.28±4.5）%，72 h：（21.5±1.8）% ，（43.4±2.4）% ，（67.4±6.1）% 和（85.6±3.9）%。與對(duì)照組相比，48 h、72 h 的 5-甲氧基色醇各濃度處理組增殖抑制率均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（

F

＝39，

F

＝114，均

P

＜0.05；8、16、32、64 μmol∕L 相鄰濃度組之間相比 48 h：

t

=4.85、13.41、10.76、10.56，

P

=0.018、0.010、0.001、0.001；72 h：

t

=7.65、12.98、20.02、18.07，

P

=0.012、0.011、0.001、0.000），72 h 增殖抑制率相比于 48 h 增殖抑制率均明顯升高。

2.2 5-甲氧基色醇促進(jìn) AML U937 細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示 ，對(duì)照組的凋亡率為（3.93±0.19）%，而 8、16、32 μmol∕L 的 5-甲氧基色醇處理組（7.5±0.33）%、（8.99±0.20）%、（13.71±0.39）%明顯增多（

F

＝24.39，

P

＜0.05；

t

=3.91、6.72、7.85，

P

=0.017、0.003、0.001）。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度（8、16、32 μmol/L）5-甲氧基色醇對(duì)急性髓細(xì)胞性白血病U937細(xì)胞凋亡的影響

2.3 5-甲氧基色醇抑制 AML U937 細(xì)胞的遷移能力

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組每視野下遷移細(xì)胞數(shù)為（205±14）個(gè)，而 8、16、32 μmol∕L 的 5-甲氧基色醇處理組（152±18）個(gè)、（124±9）個(gè)、（78±22）個(gè)明顯減少（

F

＝114.2，

P

＜0.05；

t

=8.02，13.14，14.58，

P

=0.001，0.000，0.000）。見圖2。

圖2 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度5-甲氧基色醇對(duì)急性髓細(xì)胞性白血病U937細(xì)胞的遷移能力的影響（結(jié)晶紫染色×100）：A為對(duì)照組；B為8 μmol/L的5-甲氧基色醇處理組；C為16 μmol/L的5-甲氧基色醇處理組；D為32 μmol/L的5-甲氧基色醇處理組

2.4 5-甲氧基色醇作用的蛋白靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及通路富集分析

使用在線數(shù)據(jù)庫(kù) Swiss Target Prediction 預(yù)測(cè) 5-甲氧基色醇有 100 個(gè)靶點(diǎn)蛋白，并對(duì)這 100 個(gè)靶點(diǎn)蛋白構(gòu)建蛋白互做網(wǎng)絡(luò)，對(duì)其中 Degree 得分最高的 30 個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）通路富集分析，篩選出排在前 10 位顯著富集的通路。其中，包括 PI3K-AKT 信號(hào)通路，神經(jīng)激活因子配受體互作通路，環(huán)腺苷酸（cAMP）信號(hào)通路和腫瘤發(fā)生相關(guān)通路等多個(gè)信號(hào)通路（如圖3），其中 PI3K-AKT 信號(hào)通路富集到的靶點(diǎn)最多 ，基于PI3K 和 AKT 失衡在 AML 的遷移、凋亡過程中扮演著重要角色，推測(cè) 5-甲氧基色醇抑制 AML 增殖和遷移的分子機(jī)制可能與 PI3K-AKT 信號(hào)通路有關(guān)。

圖3 5-甲氧基色醇作用的前10位蛋白靶點(diǎn)顯著富集的通路

2.5 5-甲氧基色醇減少 AML U937 細(xì)胞中 p-PI3K和 p-AKT 蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，8、16、32 μmol∕L 的 5-甲氧基色醇處理U937 細(xì)胞中 PI3K 和 AKT 蛋白的相對(duì)表達(dá)量沒有明顯的改變，而 p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯減少，提示，5-甲氧基色醇靶向 PI3K-AKT 通路抑制 P-PI3K 和 p-AKT 的活化，見圖4。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)不同濃度 5-甲氧基色醇對(duì)急性髓細(xì)胞性白血病 U937 中 PI3K、p-PI3K、AKT 和 p-AKT 表達(dá)的影響

3 討論

AML 是最常見的造血系統(tǒng)腫瘤，增殖缺陷和分化受阻是導(dǎo)致白血病干細(xì)胞能過度增殖的兩大原因。至今為止，大部分 AML 病人的治療現(xiàn)狀也不容樂觀，即使能夠通過化療使病情完全緩解，復(fù)發(fā)的比率也仍然不容樂觀，盡管目前臨床上已有的治療方案可使得部分病人疾病緩解，能夠改善部分的生存率。但多數(shù)的化療藥物在治療過程中存在藥物的毒副作用和部分病人對(duì)臨床常規(guī)的化療藥物不敏感，或者治療緩解后復(fù)發(fā)導(dǎo)致預(yù)后不等。因此如何提高臨床治療的耐藥以及病人生存率是目前亟須解決的問題。

近年來，傳統(tǒng)中藥的提取物在治療 AML 中的價(jià)值越來越被重視。Jin Y 等研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方苦參注射液通過調(diào)節(jié)過氧化物還原酶（Prdxs）∕活性氧（ROS）∕硫氧還蛋白 1（Trx1）信號(hào)通路抑制人 AML；Chen等研究發(fā)現(xiàn)，烏紅苷通過影響 AML 細(xì)胞中磷脂爬行酶 1（PLSCR1）的表達(dá)和亞細(xì)胞定位，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和分化。而 5-甲氧基色醇是 從松果中分離得到的一種天然吲哚類化合物。先前的研究表明，鵝松果體中 5-羥基吲哚和 5-甲氧吲哚在胚胎個(gè)體發(fā)育中起著重要的作用。而本研 究中發(fā)現(xiàn) 5-甲氧基色醇對(duì) AML 的增殖和遷移能力有顯著的抑制作用。進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究有助于解釋 AML 的發(fā)病機(jī)制。

生物信息學(xué)及通路富集結(jié)果顯示，5-甲氧基色醇調(diào)控 AML 的增殖和凋亡與 PI3K-AKT 信號(hào)通路密切相關(guān)。已有研究表明，PI3K∕AKT 信號(hào)通路的抑制是決定 AML 化療反應(yīng)及預(yù)后的最重要因素。PI3K 是細(xì)胞內(nèi)具有催化活性的信號(hào)蛋白，在細(xì)胞因子、藥物、應(yīng)激等因素的作用下會(huì)被激活。一旦激活，PI3K 將磷脂酰肌醇（4，5）-二磷酸磷酸化為磷脂酰肌醇（3，4，5）-三磷酸，并促進(jìn) Akt 活化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。在本研究中，5-甲氧基色醇處理抑制了 U937 細(xì)胞中 PI3K 和 Akt 的活性，其表現(xiàn)為其磷酸化水平的降低，從而降低了其下游激酶活性并抑制了該通路。

綜上所述，5-甲氧基色醇通過調(diào)節(jié) PI3K-AKT 抑制信號(hào)通路而抑制 AML U937 細(xì)胞的增殖和遷移。提示 5-甲氧基色醇有利于 AML 的治療。但是相關(guān)的具體分子機(jī)制仍不清楚，在我們課題組接下來的研究中，我們將會(huì)做進(jìn)一步的詳細(xì)研究。