清火片（膠囊）微生物限度檢查方法適用性試驗

夏天，崔迎，任文鑫，王愚，楊曉東

作者單位：西安市食品藥品檢驗所微生物室，陜西 西安 710000

清火片（膠囊）是由大青葉、大黃、石膏和薄荷腦四味藥材制成的中藥成方制劑，主要針對咽喉腫痛、牙痛、頭暈目眩、口鼻生瘡、風火目赤、便秘等癥狀，其中大青葉和大黃是主要成分。有研究表明大青葉的主要抑菌成分是黃酮類化合物，該類物質具有直接抗菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌與福氏志賀菌等多種微生物都有抑制作用，尤其針對金黃色葡萄球菌 ，抑制性明顯強于其他細菌；大黃的主要抑菌成分是蒽醌類化合物，對金黃色葡萄球菌具有很強的抑制性。建立適宜的微生物限度檢查方法，需要消除藥品對微生物的抑制性，而檢查方法確立的正確與否，也直接影響檢查結果的準確性。

為了保證清火片（膠囊）微生物限度檢查結果的客觀性和準確性，我們對清火片（膠囊）的微生物限度檢查方法進行了確認，本單位于 2018年 1—8月按照《中國藥典》2015 版四部（以下簡稱《藥典》）通則 1105 非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法和通則 1106 非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法的要求，對 22 家企業生產的清火片（膠囊）進行方法適用性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

清火片（膠囊）作為 2018年國家藥品評價性抽檢項目之一，本單位共收到 22 家企業生產的266 批次的樣品，其中清火片的生產企業為 21 家，清火膠囊的生產企業僅有 1 家。這 22 家企業均對各自生產的清火片（膠囊）做了微生物限度檢查方法適用性研究，并制訂了相應的檢查方法。本實驗室收集方法材料，并整理歸納，以便對比分析。

1.2 樣品

樣品全部來自本次國抽 項目 ，共計 22家生產企業，每家企業選擇一批清火片（膠囊）為供試品，進行方法適用性試驗。

1.3 條件要求

所有檢查環境設施均符合《藥典》的要求。試驗中凡是與供試品接觸的器皿在使用前均經過 0.1 Mpa 121 ℃濕熱 滅 菌 30 min。試驗所用培養基、稀釋液均按照《藥典》的要求配制，所用菌種均來自中國食品藥品檢定研究院。

1.4 主要儀器設備

LRH-250 型需氧菌培養箱 、MJ-Ⅱ型霉菌和酵母菌培養箱、LRH-250 型控制菌培養箱均購于上海一恒科技有限公司，SX-500 型壓力蒸汽滅菌器購于 TOMY（日本托米）公司，LFHC31 型集菌儀購于默克密理博公司。

1.5 菌種及菌液制備

菌 種 ：金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003 ］、大腸埃希菌［ CMCC（B）44102 ］、銅綠假單胞菌［ CMCC（B）10104 ］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501 ］、白色念珠菌［ CMCC（F）98001 ］、黑曲霉［ CMCC（F）98003 ］、沙門氏菌［ CMCC（B）50094 ］。

菌液制備：取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、白色念珠菌新鮮培養物，分別用 pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 10 倍遞增稀釋，制成含菌數小于 10 000 CFU∕mL的菌懸液，備用。

取黑曲霉新鮮培養物，用 3～5 mL 含 0.05%（mL∕mL）聚山梨酯 80 的 pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。然后采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含 0.05%（mL∕mL）聚山梨酯 80的 pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成含孢子數小于 10 000 CFU∕mL 的孢子懸液，備用。

1.6 微生物限度標準

根據清火片（膠囊）的質量標準和《藥典》四部 1107 非無菌藥品微生物限度標準，確定清火片（膠囊）的微生物限度標準是：需氧菌總數不得超過 10CFU∕g；霉菌和酵母菌總數不得超過 10CFU∕g；不得檢出大腸埃希菌（1 g）；不得檢出沙門菌（10 g）；耐膽鹽革蘭陰性菌應小于 10CFU（1 g）。

1.7 計數方法適用性試驗

標準規定：每次的試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在 0.5～2.0 范圍內。

供試液的制備：稱取供試品 10 g，加 pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（耐膽鹽革蘭陰性菌檢查用胰酪大豆胨液體培養基作為稀釋劑）至 100 mL，混勻，制成 1∶10 的供試液。

1.7.1 需氧菌總數計數方法適用性試驗

1.7.1.1 平皿法 清火片（膠囊）的需氧菌總數計數方法適用性試驗，首先采用平皿法，分別取 1∶10 供試液、1∶50 供試液、1∶100 供試液，1 毫升∕皿，對試驗組、菌液組和供試品對照組的菌數進行測定，按照《藥典》四部通則 1105 中的規定進行試驗，并計算供試品中微生物的回收率。

1.7.1.2 薄膜過濾法 在使用平皿法供試品試驗組的回收率達不到規定值時，則考慮采用薄膜過濾法進行進一步試驗。取 1∶10 供試液，1 毫升∕膜，每張濾膜每次沖洗量為 100 mL，分別沖洗 1 次、2 次，用pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為沖洗液，測定試驗組、菌液組和供試品對照組的菌數，按照《藥典》四部通則 1105 中的規定進行試驗，并計算供試品中微生物的回收率。

1.7.2 霉菌和酵母菌總數計數方法適用性試驗采用平皿法試驗，取 1∶10 供試液，1 毫升∕皿，分別對試驗組、菌液組和供試品對照組進行測定，按照《藥典》四部通則 1105 中的規定進行試驗，并計算供試品試驗組的回收率。

1.7.3 控制菌方法適用性試驗 控制菌包括耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌和沙門菌，均采用常規法進行方法適用性試驗。耐膽鹽革蘭陰性菌采用常規法，將 1∶10 供試液置 20～25 ℃培養 2 h，取相當于 0.1 g，0.01 g，0.001 g 供試品的預培養物，分別接種至 10 mL 腸道菌增菌液體培養基中，按照《藥典》四部 1106 規定項下方法檢查；大腸埃希菌采用常規法，取 1∶10 供試液 10 mL，接種至 100 mL 胰酪大豆胨液體培養基中，按照《藥典》四部 1106 規定項下方法檢查 ；沙門菌采用常規法，取供試品 10 g，接種至100 mL 胰酪大豆胨液體培養基中，按照《藥典》四部1106 規定項下方法檢查，分別對陽性對照組、陰性對照組、試驗組和供試品對照組進行試驗。

2 結果

2.1 樣品微生物限度檢查結果

本實驗室檢查結果全部符合《藥典》的標準規定。需氧菌總數有 207批 樣品的結 果＜10 CFU∕g，32 批 次 樣品結 果在 10～100 CFU∕g，19 批次樣品的結果在＞100～1 000 CFU∕g，而僅有 8 批樣品需氧菌總數的結果＞1 000 CFU∕g。霉菌和酵母菌總數計數有 263 批 樣 品 結 果 為 ＜10 CFU∕g，僅 3 批樣品有霉菌和酵母菌生長，結果均在20～30 CFU∕g 范圍內，控制菌檢查結果均符合規定。這為我們進行方法適用性試驗奠定了良好的基礎。

2.2 需氧菌總數檢查方法

試驗結果顯示，供試品采用平皿法計數，金黃色葡萄球菌試驗組的回收比值不在標準規定的 0.5～2.0 范圍內，而銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗組的回收比值均在該范圍內，表明清火片（膠囊）對金黃色葡萄球菌的抑制性最為顯著。而從薄膜過濾法的試驗結果看出，金黃色葡萄球菌試驗組的回收比值可以達到 0.5～2.0 之間。故清火片（膠囊）的需氧菌總數應采用薄膜過濾法（1∶10 供試液，1 毫升∕皿，不同廠家沖洗量略有不同）計數，詳見表1。

2.3 霉菌和酵母菌總數檢查方法

試驗結果表明所有供試品的白色念珠菌和黑曲霉的比值均在 0.5～2.0 范圍內，因此可以采用平皿法（1∶10 供試液，1 毫升∕皿）對 清火片（膠囊）進行霉菌和酵母菌總數計數。

2.4 控制菌檢查方法

所有供試品的陽性對照試驗均檢出陽性菌，陰性對照試驗均未生長，試驗組均檢出陽性菌。因此，可以采用常 規法對清火片（膠囊）進行控制菌檢查。

2.5 小結

2018年國家評價性抽驗項目——清火片（膠囊）（共計 22 個廠家）的微生物限度檢查方法為：需氧菌總數計數采用薄膜過濾法（1∶10 供試液，取 1 毫升∕皿過濾，不同廠家的沖洗量略有不同），霉菌和酵母菌總數計數采用平皿法（1∶10 供試液，取 1毫升∕皿），耐膽鹽革蘭陰性菌采用常規法（1∶10 供試液 20～25 ℃培養 2 h，取相當于 0.1 g，0.01 g，0.001 g供試品的預培養物分別接種至 10 mL 腸道菌增菌液體培養基中，按照《藥典》四部 1106 規定項下方法檢查），大腸埃希菌采用常規法（取 1∶10 供試液 10 mL，接種至 100 mL 胰酪大豆胨液體培養基中，按照《藥典》四部 1106 規定項下方法檢查），沙門菌采用常規法（取供試品 10 g，接種至 100 mL 胰酪大豆胨液體培養基中 ，按照《藥典》四部1106規定項下方法檢查）。

3 討論

根據各企業提供的微生物限度檢查方法，266批次清火片（膠囊）的微生物限度檢查結果全部符合 規 定 。 其中 78% 樣品的需氧菌總數結果為 0，97% 樣品的需氧菌總數在 1 000 CFU∕g 以內，有 8 批次樣品超過 1 000 CFU∕g，最高值為 3 000 CFU∕g。檢查結果表明少數批次的清火片（膠囊）存在不同程度的微生物污染情況，影響因素可能包括：樣品的原輔料來源和質量不同；樣品在生產過程和儲存環境中的溫濕度存在差異；藥材提取工藝中具體參數不盡相同；人員操作規范程度等等，這些情況都會影響樣品微生物載荷。另外，清火片（膠囊）含有藥材原粉，也會增加樣品攜帶微生物的概率。266批次樣品微生物限度檢查結果全部符合規定，從側面反映出隨著新版《藥品生產質量管理規范》的頒布與實施，國內藥品生產企業在人、機、料、法、環、測等方面的管理越來越規范，衛生水平得到提高，保障了藥品使用的安全性，這一點值得肯定。

表1 清火片需氧菌總數計數方法適用性試驗結果比較

本次試驗的結果顯示，清火片（膠囊）微生物限度檢查方法差異最大的項目是需氧菌總數計數，僅1 家企業生產的清火片與企業提供的試驗方法相同，其余 21 家企業提供的計數法為平皿法，而本單位驗證結果為薄膜過濾法。分析這種差異的原因，可能有以下幾個方面：各實驗室菌種來源、保藏和傳代情況不同，導致菌種活力上的差異；供試液制備時的溫度、加熱方式與保溫時間不同，導致供試液藥物有效成分含量的差異；另外操作人員、儀器耗材與環境的不同也可能引起不同的試驗結果。21 家企業生產的清火片的微生物限度檢查法在本實驗室未得到重現，這種情況值得關注。

整理本單位收集到的所有清火片（膠囊）微生物限度檢查方法材料，發現一些不規范的情況。第一，白 色念珠菌與黑曲霉既要作為 需氧菌總數用TSA 進行計數方法性試驗，也要作為霉菌和酵母菌總數用 SDA 進行計數方法適用性試驗，二者缺一不可。第二，控制菌的方法適用性試驗必須做陽性對照試驗，有的企業只做了試驗組和陰性對照組，并未做陽性對照試驗。

各廠家產品需氧菌總數計數采用的薄膜過濾法，沖洗量略有不同，這可能是由于各個廠家的原料來源不同，成品中有效成分含量存在差異，導致抑菌活性有所不同。

清火片的成分是大青葉、大黃、石膏、薄荷腦，輔料為淀粉，其中大青葉和大黃兩味藥材是主要成分，有研究表明大青葉對細菌的抑制性相對較強，尤其是對金黃色葡萄球菌的抑制效果更為明顯，大黃對金黃色葡萄球菌也有很強的抑制性。本次清火片微生物限度檢查驗證試驗中，發現采用平皿法對清火片需氧菌總數進行計數方法適用性試驗時，金黃色葡萄球菌的試驗組回收比值不能達到規定范圍，而在改用薄膜過濾法后，金黃色葡萄球菌的試驗組回收率均達到規定值。不難看出，清火片（膠囊）對金黃色葡萄球菌的抑制作用最為顯著，恰恰印證了上述研究結論。