肝癌病人腸道菌群與血氨、血清膽堿酯酶的相關性

劉波 ，王少敏 ，袁岸龍

作者單位：孝感市中心醫院（武漢科技大學附屬孝感醫院），a 檢驗科，b 消化內科，湖北 孝感 432000

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，主要致病因素有酒精性肝炎、肝炎病毒、慢性肝病、遺傳等。肝癌的發生通常會經過肝炎、肝硬化、肝癌三個階段。肝臟與腸道在解剖結構上聯系緊密，二者可形成微生態循環，腸道菌群的失調能夠產生毒素物質并進入肝腸循環，從而在肝臟疾病中發揮重要作用。人體內含有微量血氨，血氨是蛋白質代謝過程中產生的氨基酸脫氨基而成，對人體有害，肝臟可將其代謝，合成為尿素或其它含氮化合物隨尿液排出。在肝臟功能受損時，無法完成上述過程致使血氨濃度升高，因此血氨是一個反映肝臟功能的重要指標。膽堿酯酶是由肝臟合成的非特異性酶，由乙酰膽堿酯酶和擬膽堿酯酶兩部分組成。乙酰膽堿酯酶主要分布于紅細胞、腦脊液以及中樞神經系統的灰質中 ；擬膽堿酯酶主要存在于肝臟 、淋巴液和血漿中。血清膽堿酯酶主要指的是擬膽堿酯酶，當肝細胞出現損傷時，血清中擬膽堿酯酶將不斷減少，是檢測肝細胞合成蛋白功能的靈敏指標。但肝癌病人中，腸道菌群與血氨、血清膽堿酯酶水平關系尚不十分明確，因此本研究通過觀察肝癌病人腸道菌群及血氨、血清膽堿酯酶水平的表達情況，分析三者關系，以期為肝癌病人的早期診療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取 2017年 8月至 2018年12月孝感市中心醫院收治的 98例肝癌病人為肝癌組，均符合《原發性肝癌診療規范（2011年版）》中的診斷標準 ，其中男52例，女46例，年齡（52.74±9.20）歲，范圍為 35～66歲；按照美國癌癥聯合委員會（AJCC）第7 版臨床分期標準分為Ⅰ期 20例，Ⅱ期 32例，Ⅲ期 25例，Ⅳ期 21例。納入標準：飲食習慣無偏好，年齡均＞18歲，臨床資料完整；排除標準：所有病人排除合并自身免疫性肝病、遺傳代謝性肝病等其他病因，無合并冠心病、糖尿病、腎臟疾病等。同期肝硬化病人 92例作為對照組，其中男 48例，女 44例，年齡（51.3±8.7）歲 ，范圍 為 37～65歲 。兩組性別、年齡一般情況比較，差異無統計學意義（

P

＞0.05）。本研究經孝感市中心醫院組織倫理委員會批準（XGLY2018-01-06），樣本的獲取均取得研究對象的知情同意。

1.2 主要儀器與試劑

全自動生化分析儀 OLYMPUS AU640，購自鄭州安圖綠科生物工程有限公司；血氨檢驗試劑，購自北京利德曼生 化股份有限公司；膽堿酯酶酶法試劑，購自北京九強生物技術股份有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集 分別采集兩組受試者清晨空腹（＞8 h）靜脈血 5 mL，取 3 mL 置于促凝試管中，3 500 r∕min 離心 5 min，吸取血清標本置于 Eppendrof 管中，保存在-80 ℃中用以測定膽堿酯酶；余下 2 mL靜脈血置于檸檬酸鹽抗凝試管中，用以檢測血氨，應在 2 h 內完成測定。同時分別采集兩組受試者的新鮮糞便 0.5 g，進行微生物培養，操作在 15 min 內完成。

1.3.2 微生物培養 收集的新鮮糞便用稀釋液稀釋至 10，滴注法接種于選擇培養基上。對 10 種具有代表性的腸道優勢菌做定性定量培養，其中厭氧菌 6 種（擬桿菌、乳桿菌、真桿菌、雙歧桿菌、消化球菌、梭菌），需氧菌 4 種（酵母菌、腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌）。厭氧菌在厭氧罐中 37 ℃培養 72 h，需氧菌在恒溫培養箱中 37 ℃培養 24～48 h。選取菌落數在 30～300 的培養基進行計數 ，同一稀釋度取平均數。

1.3.3 連續監測法檢測血氨含量 將置于檸檬酸鹽抗凝試管中的 2 mL 靜脈血，3 000 r∕min 離心 10 min，選用全自動生化分析儀，以連續檢測法對血氨水平進行測定，嚴格按試劑盒操作說明書進行，并確保在 2 h 內完成檢測。血氨正常參考值為 10～47 μmol∕L。

1.3.4 假性膽堿酯酶速率法檢測膽堿酯酶的表達從-80 ℃取出保存的血清標本，按照膽堿酯酶試劑盒的操作說明進行檢測，使用全自動生化分析儀在405 nm 處連續監測吸光度的變化，其下降速度與樣本膽堿酯酶的活力呈正比。膽堿酯酶的正常參考值為 3 800～13 000 U∕L。

2 結果

2.1 兩組腸道菌比較

肝癌組病人腸道內擬桿菌、乳桿菌、真桿菌、雙歧桿菌、消化球菌、酵母菌、腸桿菌及葡萄球菌均比對照組減少（

P

＜0.05）。見表1。

2.2 兩組血氨、血清膽堿酯酶水平比較

肝癌組血氨水平明顯高于對照組（

P

＜0.05），而血清膽堿酯酶水平則明顯低于對照組（

P

＜0.05）。見表2。

2.3 肝癌病人不同臨床分期血氨、血清膽堿酯酶水平比較

肝癌病人不同臨床分期血氨、血清膽堿酯酶水平比較，均差異有統計學意義（

P

＜0.05）。進一步兩兩比較發現，肝癌Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ期病人血氨水平明顯高于Ⅰ期病人，血清膽堿酯酶水平明顯低于Ⅰ期病人（

P

＜0.05）；肝癌Ⅳ、Ⅲ期病人血氨水平顯著高于Ⅱ期病人，血清膽堿酯酶水平顯著低于Ⅱ期病人（

P

＜0.05）；肝癌Ⅳ期病人血氨水平明顯高于Ⅲ期病人，血清膽堿酯酶水平明顯低于Ⅲ期病人（

P

＜0.05）。見表3。

表1 兩組腸道菌比較∕（lgCFU∕g

表2 兩組血氨、膽堿酯酶水平比較

表3 肝癌病人 98例不同臨床分期血氨、血清膽堿酯酶水平比較

2.4 肝癌病人腸道菌與血氨、血清膽堿酯酶的相關性

肝癌病人體內的擬桿菌、雙歧桿菌、酵母菌、腸桿菌及葡萄球菌與血氨水平均呈負相關（

P

＜0.05），與血清膽堿酯酶水平均呈正相關（

P

＜0.05）；而乳桿菌、真桿菌及消化球菌與血氨水平、血清膽堿酯酶水平均無顯著相關性（

P

＞0.05）。見表4。

3 討論

肝癌發病率位居所有腫瘤疾病第6 位，病死率高居第3 位。肝癌就診時多為中晚期，治療效果較差。而肝癌的發病機制與病因尚未明確，其發生發展可能與病毒性肝炎、肝硬化有緊密聯系。

表4 肝癌病人 98例腸道菌與血氨、血清膽堿酯酶的相關性

成人腸道中正常情況下定植 約 4×10個微生物，其中大部分為厭氧菌，構成人體最重要的微生態系統。菌群平衡對腸道免疫和全身穩態有重要作用，一旦該平衡被打破，將會導致嚴重病變。大量研究證實，恢復腸道微生態平衡，改善菌群失調及維持腸道屏障功能對疾病的治療具有重大意義。研究表明，腸道菌群在肝臟疾病中主要通過炎癥信號通路起作用，由腸道細菌、肝臟和免疫系統間的相互作用觸發。肝癌病人的門脈高壓會造成胃腸道淤血、水腫，影響胃的消化吸收，進而為腸道細菌的繁殖提供適宜環境；肝功能受損導致蛋白質合成下降，胃腸道淤血、水腫進一步加重，神經-體液調節可抑制胃腸黏膜的吸收、分泌功能，以上因素均可對腸道屏障功能造成損害，增加腸黏膜通透性，引發腸道菌群的易位。而腸道菌群及其代謝產物通過肝腸循環進入肝臟，激活肝臟相關免疫細胞或與其表面 Toll 樣受體結合，釋放炎性因子，產生炎癥反應，加速肝纖 維化和肝硬化的發生發展，導致疾病惡化，最終形成肝癌。本研究對肝癌病人體內的 10 種腸道菌進行體外培養，與對照組相比，肝癌組病人腸道內擬桿菌、乳桿菌、真桿菌、雙歧桿菌、消化球菌、酵母菌、腸桿菌以及葡萄球菌均比對照組減少，提示肝癌病人的部分腸道菌被抑制，腸道菌群發生改變，可能造成肝功能損傷。

肝細胞功能損傷可導致鳥氨酸循環在肝內代謝受阻，從而使腸道中的 氨無法有效的轉化成尿素，隨尿液排出體外；或因門-體側支循環的建立，腸道中的氨直接進入體循環而不經由肝臟進行解毒，最終導致血氨含量上升。研究證明，肝硬化病人門靜脈血壓增高，造成食管靜脈曲張破裂出血，血紅蛋白在腸道中分解導致氨水平升高。有研究表明，肝硬化病人的血氨含量與肝功能分級有一定聯系，血氨水平越高，肝功能分級越高。本研究結果顯示，肝癌病人血氨水平遠高于對照組，且隨著臨床分期的增高，血氨水平呈上升趨勢，提示肝癌病人可能由于食管靜脈出血或肝細胞損傷等原因引起血氨水平升高，但具體尚需進一步研究。

膽堿酯酶是一種非特異性酯酶，肝臟是其合成的唯一場所。肝細胞受損或變性壞死、間質炎癥細胞浸潤或纖維結締組織增生，均可造成肝臟合成酶的能力下降，導致膽堿酯酶活性及血清膽堿酯酶濃度降低，因此檢測血清中膽堿酯酶水平對肝臟疾病的診斷具有較高的敏感性。膽堿酯酶是肝臟病變后唯一表達下降的酶，且不受輸血及血漿蛋白的影響，可作為判斷肝病嚴重程度的指標，有利于肝臟疾病的診斷。研究顯示，肝臟病變程度與血清膽堿酯酶之間呈負相關，即肝功能分級越高，血清膽堿酯酶水平越低。本研究結果顯示，肝癌病人血清膽堿酯酶水平遠低于對照組，且隨著臨床分期的增高，血清膽堿酯酶水平呈下降趨勢，提示肝癌病人可能由于肝細胞受損或變性壞死導致血清膽堿酯酶水平降低。進一步研究發現，肝癌病人體內的擬桿菌、雙歧桿菌、酵母菌、腸桿菌及葡萄球菌與血氨水平呈負相關，與血清膽堿酯 酶水平呈正相關，提示以上 5 種腸道菌的變化可能會影響血氨及血清膽堿酯酶的水平。

綜上所述，腸道菌群數量下降、血氨水平升高及血清膽堿酯酶水平降低可能共同參與肝癌發生，臨床觀察三者變化可能有利于肝癌的早期診療。但本研究選取的腸道菌種類較少，研究不夠全面，下一步應擴大樣本繼續研究。