巨噬細胞移動抑制因子和細胞間黏附分子-1 在慢性牙周炎合并動脈粥樣硬化大鼠模型中的表達分析

龐雪晶

作者單位：昆明市兒童醫院口腔科，云南 昆明 650000

慢性牙周炎（CP）是發生于牙周支持組織的一種慢性炎性疾病，伴有進行性的牙周組織附著喪失和牙槽骨吸收破壞。動脈粥樣硬化（AS）是心血管疾病發生率和死亡率的主要原因。流行病學調查顯示牙周炎可增加人患心血管疾病的風險，口腔細菌感染與心血管疾病之間存在密切聯系。研究表明牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis）感染導致牙周軟組潰瘍出血，進而入血、黏附和侵入血管內壁引起局部炎癥反應，是促進 AS 發展的重要原因。

巨噬細胞移動抑制因子（MIF）是一種多功能蛋白 ，作為細胞因子起作用 ，是炎癥的主要調節因子。MIF 作為動脈粥樣硬化形成的主要調節因子之一，通過促進單核細胞的募集，激活炎癥信號通路，將巨噬細胞轉分化為泡沫細胞以及增強膠原酶表達和基質降解，可導致 AS 斑塊不穩定，這直接關系到疾病的進展。將載脂蛋白基因（ApoE-∕-）或低密度脂蛋白受體基因敲除小鼠的 MIF 表達阻斷，可使已形成的 AS 斑塊退縮變小。由此可見 MIF 在AS 病變中具有重要作用 。 細胞間黏附分子 -1（ICAM-1）的表達和活性升高是內皮功能障礙表型的特征，在 AS 形成期間，內皮細胞使黏附分子表達升高，啟動細胞骨架重組，這是單核細胞募集到血管壁中不可或缺的。近年來，ICAM-1 在牙周炎中的作用逐漸得到關注，ICAM-1 是牙齦表面的黏附蛋白，主要通過細胞間信息傳遞、驗證和免疫反應參與牙周炎的發生和發展過程。慢性牙周炎組織中的 ICAM-1 升高進而影響血清中 ICAM-1 的水平，血液中 ICAM-1 的升高可導致循環系統中的白細胞與血管內皮細胞的黏附，引發心血管疾病的發生。

本研究于 2019年 1—12月通過建立牙周炎動脈粥樣硬化的復合動物模型，在體內驗證 P.gingivalis 造成的牙周感染是否可使大鼠血清中及動脈組織中 MIF、ICAM-1 表達升高。本研究將為闡明慢性牙周炎感染促進 AS 樣疾病的發生發展提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細菌培養

牙齦卟啉單胞菌菌株常規復蘇后接種于 BHI 血瓊脂培養基，37 ℃厭氧條件（80% 氮氣、10% 二氧化碳、10% 氫氣）培養 5～7 d，取菌落傳代培養 3～4 d，液體增菌 1～2 d，紫外分光光度計 600 nm 下調整菌液濃度至大約 1.0×10CFU∕mL，用于大鼠口腔接種。

1.2 實驗動物及分組

24 只健康的雄性 SD 大鼠，8周齡，體質量范圍為（220±10）g，動物飼養于 SPF 級動物房。用隨機數字法分配為四組，分別為 NC 組、CP 組、AS 組及 CP+AS 組，每組各 6 只。實驗前所有大鼠飲水中給予復方磺胺甲噁唑片即 1 g∕L 磺胺甲噁唑和 200 mg∕L 的甲氧芐胺嘧啶 3 d 以抑制不利于牙齦卟啉單胞菌定植的內源性細菌。實驗動物使用許可證號為 SYXK（粵）2019-0074，本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.3 建模方法

NC 組：腹腔注射生理鹽水及口腔內涂生理鹽水作為對照，標準飼料飼養 12周。CP組：將牙齦卟啉單胞菌（1.0×10CFU∕mL）接種于上頜第二磨牙齦溝內。以后在異氟烷鎮靜下每周接種 2 次，標準飼料喂飼，每周檢查結扎絲 1 次，有脫落者及時重新結扎。AS 組：先標準飼料喂飼，1周內逐漸增加高脂飼料比例直至完全替代標準飼料（高脂飼料喂飼 20～25 g∕d）。在高脂飲食的基礎上于行大鼠左側頸動脈內膜球囊損傷術（參照 Tulis的手術方法）。同時腹腔注射維 生素 D3 針劑 60 萬 IU∕Kg，從第2周每周腹腔注射 1 次維生素 D3 10 萬 IU∕Kg，共注射 3 次。高脂飼料繼續喂養 12周。CP+AS組：牙周炎建模處理同 CP 組，動脈粥樣硬化建模處理同 AS 組。

1.4 取材

大鼠處死前 12 h 禁食不禁水，將大鼠麻醉后仰臥位固定于手術臺上進行取材。

1.5 觀察記錄與檢測

每天觀察大鼠精神狀態，每周更換新鮮飲水。每 2周進行 1 次體質量的測量。由同一人使用 Hu-Friedy 牙周探針測量上頜左、右第二恒磨牙齦溝出血指數（SBI）（1971，Muhleman 和Son 記分標準記 0～5 分），取平均值。在放大的體視顯微鏡下（×40）對染色后的上頜第二磨牙的頰舌側進行標準化的圖像采集。用橡皮泥做兩個約 3 cm的長條，將頜平面與長條垂直，牙齒長軸與相機垂直。長條上有固定參考點來保證照片的標準化。Image-Pro Plus6.0 軟件分析頰腭側由釉牙骨質界（CEJ）、近遠中軸線角、牙槽嵴頂所圍成的多邊形面積，比較面積的大小從而推測骨吸收的多少。頰舌側面積之和記為該鼠的骨喪失量。將 4% 的多聚甲醛固定的動脈組織進行脫水石蠟包埋切片，常規蘇木精-伊紅（HE）染色后光學顯微鏡下觀察，評估頸動脈病變情況。

1.6 酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測血清中 MIF及 ICAM-1 的表達

從-80 ℃超低溫冰箱中取出血清樣本，在室溫解凍半小時以上，檢測前根據預試驗結果稀釋 ，用 ELISA 試劑盒測定標本中 MIF 及ICAM-1 含量。

1.7 免疫組化檢測動脈組織中 MIF 及 ICAM-1 的表達

石蠟切片脫蠟，浸泡于 3% 過氧化氫中，洗滌后，MIF 抗體或者 ICAM-1 抗體（1∶200）4 ℃孵育過夜，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗，37 ℃ 30 min，PBS 沖洗，DAB 顯色，復染，封片；與抗體相結合的區域出現棕黃色的改變，細胞質中的棕黃色程度越高，代表陽性反應越強 。 通過圖像分析軟件 Image-pro Plus 6.0 對動脈組織中 MIF 和 ICAM-1 陽性區域進行半定量分析：在高倍鏡下（×200），每張切片隨機選取 3 個不同視野，對血管組織中 MIF 和 ICAM-1 染色陽性部位的透光強度進行分析，結果用平均吸光度表示，將 3 個視野的平均值作為此片 MIF 和 ICAM-1含量的最終數據。

2 結果

2.1 牙槽骨吸收水平分析

體視顯微鏡圖示（圖1），IPP 圖像分析軟件顯示：NC 組牙槽骨吸收面積為（5.11±0.99）mm，CP 組 為（9.46±3.07）mm，AS 組為（5.50±0.74）mm，CP+AS 組 為（9.58±3.53）mm。CP 組及 CP+AS 組牙槽骨吸收面積高于其他兩組（

P

＜0.05）。結合 SBI 數據結果，可認為本實驗 CP 組及CP+AS 組成功建立起牙周炎動物模型。

2.2 血脂的檢測分析

血脂檢測結果顯示 AS 組、CP+AS 組三酰甘油、總肝固醇、LDL 均較 NC 組、CP組升高（

P

＜0.05），其中 AS 組升高最為明顯，其次為CP+AS 組；AS、CP+AS 組 HDL 較 NC、CP 組降低（

P

＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清血脂水平比較∕（mmol∕L

2.3 頸動脈組織病理組織學檢查結果

病理組織學檢查顯示：NC 組可見內膜、中膜和外膜分界清楚，管腔面由單層血管內皮細胞覆蓋，細胞完整，中膜主要可見排列整齊平滑肌細胞。CP 組與 NC 組病理表現相似，但中膜平滑肌細胞增生，動脈壁略增厚，有極少量炎性細胞浸潤。AS 組、CP+AS 組管壁內皮細胞脫落，內膜增厚，突出的斑塊內含有壞死物質，炎性細胞浸潤以及少量的泡沫細胞，平滑肌細胞減少，排列紊亂，嗜堿性增強，中膜明顯萎縮，可見小血管管腔。結合血脂數據結果可認為本實驗 AS 組及 CP+AS 成功建立了大鼠動脈粥樣硬化動物模型，見圖2。

2.4 血清 MIF 及 ICAM-1 表達水平分析

2.4.1 血清 MIF 表達水平分析 血清 MIF 表達水平四組間比較：NC 組（42.93±2.63）μg∕L、CP 組（45.57±2.59）μg∕L、AS 組（50.88±4.20）μg∕L 及 CP+AS 組（59.40±3.92）μg∕L（

F

=36.723，

P

=0.011）。 AS 組 及CP+AS 組血清 MIF 水平高于 CP 組及NC組（

P

＜0.05），其中 CP+AS 組最高（

P

＜0.05）；CP 組 與 NC 組差異無統計學意義（

P

＞0.05）。2.4.2 血清 ICAM-1 表達水平分析血清 ICAM-1表達水平四組間比較：NC 組（1.33±0.25）μg∕L、CP 組（3.99±0.44）μg∕L、AS 組（4.19±0.89）μg∕L 及 CP+AS 組（6.77±1.47）μg∕L（

F

=33.821，

P

=0.002）。CP+AS 組高于其他三組（

P

＜0.05），AS 組與 CP 組高于 NC 組（

P

＜0.05），AS 組與 CP 組差異無統計學意義（

P

＞0.05）。

2.5 動脈組織中 MIF 與 ICAM-1 表達水平分析

2.5.1 動脈組織中 MIF 表達水平分析 免疫組織化學染色顯示，MIF 在動脈組織全層中均呈陽性表達，且 分 布面積 較廣（圖3A～3D）。四組 間比較 ：NC 組MIF 吸 光 度 為（0.096±0.010），CP 組 為（0.010±0.011），AS 組為（0.127±0.011），CP+AS 組為（0.152±0.022）（

F

=48.271，

P

＜0.001）。CP+AS 組 MIF 水平高于其他三組（

P

＜0.05），AS 組 MIF 水平高于 CP 組及NC 組（

P

＜0.05），CP 組與 NC 組之間差異無統計學意義（

P

＞0.05）。

圖1 體視顯微鏡觀察各組大鼠牙槽骨破壞情況（×40）：A為NC組第二磨牙未見明顯骨破壞；B為CP組第二磨牙牙槽骨吸收至牙根1/3～1/2；C為AS組第二磨牙未見明顯骨破壞；D為CP+AS組第二磨牙牙槽骨吸收至牙根根尖1/3，根分叉區骨破壞 圖2 各組大鼠動脈組織的病理圖（HE染色×100）：A為NC組血管壁內膜、中膜及外膜界限明顯，未見明顯異常；B為CP組血管壁內膜、中膜及外膜界限明顯，箭頭示血管壁略增厚；C為AS組內膜明顯增厚，炎細胞浸潤，彈力纖維排列紊亂、斷裂，黑色箭頭示斑塊內壞死物，灰色箭頭示該區域嗜堿性增強；D為CP+AS組內膜明顯增厚，炎細胞浸潤，彈力纖維排列紊亂、斷裂，黑色箭頭示中性粒細胞浸潤，灰色箭頭示小血管管腔形成 圖3 各組大鼠頸動脈組織中巨噬細胞移動抑制因子（MIF）和細胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達（免疫組織化學染色×200）：A～D分別為NC組、CP組、AS組及CP+AS組MIF的表達水平；E～H分別為NC組、CP組、AS組及CP+AS組ICAM-1的表達水平

2.5.2 動脈組織中 ICAM-1 表達水平分析 免疫組織化學染色顯示，ICAM-1 在動脈組織全層中均呈弱陽性表達（圖3E～3H），四組實驗大鼠組間比較：動脈組織中 NC 組 ICAM-1 吸光度為（0.133±0.012），CP組為（0.156±0.006），AS 組 為（0.182±0.025），CP+AS組 為（0.197±0.033）（

F

=42.283，

P

＜0.001）。 AS 組 、CP+AS 組 ICAM-1 水平高于 NC 組及 CP 組（

P

＜0.05），CP 組與 NC 組之間差異無統計學意義（

P

＞0.05）。

3 討論

頸動脈內膜中層厚度被認為是早期動脈粥樣硬化的標志物 ，也是心血管結局的良好預測指標。因基因敲除小鼠較昂貴，飼養條件較嚴格，且口腔操作空間較大鼠更困難，所以在本實驗中還是選取大鼠來建立動物模型。本實驗另一個技術難點即球囊損傷術建立 AS 模型，對血管內皮進行機械損傷，加速病變的形成。病理結果顯示雖未出現鈣化斑塊的形成，但近似于人類 AS 病變的中期即纖維斑塊期。

三酰甘油 ，總肝固醇 ，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）是高脂血癥診斷和心血管疾病風險分類的主要測量指標。其中三酰甘油，總肝固醇，LDL-C 升高與 AS 發病呈正相關，HDL-C 有抗 AS 的作用。LDL 水平的升高受到最多關注，在幾乎所有降脂試驗中，LDL-C 水平已被用作治療或干預的主要目標。在本實驗中血脂檢測結果可見 CP 組、CP+AS 組血清三酰甘油、總肝固醇 、LDL 水 平 較 NC 組、CP 組明顯升高（

P

＜0.05），AS 組、CP+AS 組血清 HDL 水平較 NC 組、CP組明顯低（

P

＜0.05）。大鼠的高脂血癥形成。高血脂是建立 AS 模型的重要條件之一。研究表明 MIF 在心血管疾病的發生和發展中發揮著重要作用。有研究顯示急性心梗病人的血漿中 MIF 水平要高于健康對照組。MIF 在人類動脈粥樣硬化斑塊形成中的各個階段由動脈粥樣硬化相關細胞（如平滑肌細胞、內皮細胞、單核細胞和T 細胞）大量表達。動物實驗研究顯示在正常情況下血管內皮細胞（VEC）中的 MIF 的 mRNA 表達呈弱陽性，不能觀察到 MIF 蛋白表達，而在 AS 斑塊處MIF 表達顯著增高。研究表明，導致 AS 發生的因素（如氧化 LDL 和凝血酶）以時間和濃度依賴的方式上調 MIF 表達。本實驗的研究顯示 AS 組以及 CP+AS 組中血清及動脈組織中 MIF 表達水平較NC 組以及 CP 組較高（

P

＜0.05），與上述實驗結果相一致。MIF 在牙周炎領域的研究目前較少，有研究表明在人類的齦溝液中可以檢測出 MIF 的表達，在有深牙周袋的牙周組織中 MIF 表達水平升高，而在 Lira-Junior 等的研究發現 MIF 在正常組和牙齦炎組以及侵襲性牙周炎組的血清和唾液中的表達沒有明顯差別。在本實驗中 NC 組以及 CP 組 MIF在血清及動脈組織中表達水平差異無統計學意義，因此 MIF 在 CP 中的確切作用需要更多研究來證實。在 CP 組、AS 組、CP+AS 組 MIF 的血清及動脈組織中表達水平依次升高，提示我們慢性牙周炎局部感染可能可以使血清 MIF 水平升高，從而促進動脈粥樣硬化病變的發生發展過程。

ICAM-1 是一種重要的表面黏附分子，在動脈粥樣硬化形成的各個階段都有很重要的作用，已成為動脈粥樣硬化形成的重要組成部分 。 可溶性的ICAM-1 存在于健康者及牙周炎病人的齦溝液中，在 ICAM-1 對結合上皮細胞的特異性輔助下，多形核白細胞可以進入牙齦和牙周袋，起到殺菌的作用，具有強效的免疫調節和抗炎特性，ICAM-1 水平與牙周炎癥程度呈正相關。本實驗結果顯示：在血清 中 CP 組、AS 組及 CP+AS 組 ICAM-1 的表 達 水平均高于 NC 組，其中 CP+AS 組表達水平最高，可以推測慢性牙周炎的存在可能可以使血清中 ICAM-1 表達量升高，從而影響動脈粥樣硬化的形成；動脈組織中 AS 組及 CP+AS 組 ICAM-1 的表達水平高于 NC組及 CP 組，CP+AS 組 ICAM-1 的表達水平略高于 AS組，但無統計學意義。可以推測慢性牙周炎的存在可能并沒有使動脈組織中 ICAM-1 表達升高。

MIF 可以干擾黏附分子和細胞因子的表達，將MIF 的 RNA 沉默可降低 E-選擇蛋白、ICAM-1、血管細胞黏附分子 1、白細胞介素-8 和趨化因子 2 的表達。既往已有細胞實驗結果表明牙齦卟啉單胞菌感染血管內皮細胞時可以誘導 MIF 及 ICAM-1 的分泌增多。 利用MIF 拮抗劑 ISO-1 中 和 MIF 后 ，ICAM-1 的表達受到明顯抑制；加入外源性 MIF 恢復其功能后 ICAM-1 表達量升高，說明牙齦卟啉單胞菌感染血管內皮細胞上調 ICAM-1 的表達有一定的MIF 依賴性。根據本實驗結果可得出在 CP 促進 AS的進程中 MIF 和 ICAM-1 可能起到一定的調節作用，但兩者在動脈粥樣硬化形成過程中的相互作用在本實驗中尚未證明，還需要其他實驗來證實。比如利用 MIF 基因敲除的大鼠或其他體型較大的動物建立牙周炎和動脈粥樣硬化的復合模型檢測 ICAM-1的表達情況，從而探究兩者之間的關系。本課題組可考慮后續實驗對其進行驗證。

綜上所述，本實驗通過建立牙周炎合并動脈粥樣硬化的動物模型，檢測了 MIF 及 ICAM-1 在蛋白水平的表達，為牙周炎和動脈粥樣硬化之間關系提供了一定的理論基礎。提示我們在臨床工作中遇到伴有慢性牙周炎的心血管疾病病人時，應進行早期的診斷和積極的牙周治療。完善的牙周治療可以轉化為炎性介質領域和脂質特征的標志物的改善，從而使心血管疾病風險降低。

（本文圖1～3 見封三）