基質金屬蛋白酶-1 mRNA、A-2 巨球蛋白 mRNA 在創傷性關節炎病人軟骨中的表達及與病情嚴重程度的相關性

馮利君，張允帥，王宸

作者單位：開封市中心醫院骨科，河南 開封 475000

創傷性關節炎（Post-traumatic osteoarthritis，PTOA）主要以關節軟骨退化、變性及繼發性關節軟骨增生與硬化為病理特點，可引起關節疼痛與功能障礙，嚴重降低病人生活質量。基質金屬蛋白酶-1（Matrix metalloproteinase-1，MMP-1）作用底物主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原和蛋白多糖，在大鼠骨性關節炎、類風濕性關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）中呈高表達。A-2 巨球蛋白（A-2 macroglobulin，A2M）是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，在股骨頭壞死者關節囊滑膜組織中呈低表達。 現階段關于 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 在PTOA病人軟骨中的表達及與病情嚴重程度相關性的報道較少，是否有助于鑒別 PTOA、RA 仍不明確。本研究對此進行探討，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取開封市中心醫院 2018年 1月至 2019年 6月收治的 PTOA 病人 76例作為PTOA 組 ，另選取同期該院 RA 病人72例作為 RA組。兩組性別、年齡等一般資料均衡可比（

P

＞0.05），見表1。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

表1 兩組創傷性關節炎病人臨床資料對比

1.2 納排標準

納入標準 ：PTOA、RA 分別符合PTOA、RA 診斷標準；以往無 PTOA、RA 手術治療史；入組前 1 個月無相關藥物應用史；無血液系統疾病。排除標準：合并膝關節結核者；合并骨折者；妊娠期、哺乳期病人。

1.3 方法

1.3.1 軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表達的檢測 （1）主要試劑、儀器：Trizol（武漢科昊佳生物科技有限公司）；RNase-free ddHO（上海索寶生物科技）；Prime ScriptRT Enzyme Mix［寶生物（大連）工程有限公司］；5×PrimeScript Buffer［寶生物工程（大連）有限公司］；Nuclease-Free Water（北京冬歌博業生物科技有限公司）；熒光定量 PCR 儀（美國 ABI-7300）。（2）檢測方法：治療前，均在病人知情同意條件下，采集適量脛骨平臺軟骨組織，液氮保護下研磨成碎末，加入含有 1 mL Trizol 的 EP 管中，冰上靜置 15 min，加入 0.2 mL 三氯甲烷，充分混勻，室溫放置 5 min，12 000 r∕min 離心 15 min，轉移上層水相500 μL 至 新 的 EP 管中，加入等體積的異丙 醇，混勻，室溫靜置 20 min，12 000 r∕min 離心 10 min，上清棄之，可見細小白色膠狀沉淀。加入 1 mL 預冷的用RNase-free ddHO 與 100% 乙醇配置的 75% 冰乙醇，8 000 r∕min 離心 5 min，管內液體棄之，室溫放置 0.5 h，加入 RNase-free ddHO 20 μL 混勻，分光光度計檢測總 RNA 純度與質量。按以下逆轉錄反應體系進行逆轉錄反應，條件 37 ℃ 15 min，95 ℃ 5 s，4 ℃ 60 min，得到互補 DNA（cDNA），采用實時熒光定量PCR 檢測各基因表達，引物序列、PCR 反應體系如下，反應條件 95 ℃ 15 min 預變性，95 ℃ 5 s 變性，55 ℃ 30 s 退火，72 ℃ 30 s 延伸，溶 解曲 線 95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，循環 1 次，4 ℃保存，用相對內參的表達量表示各目的基因表達量。由該院檢驗室統一完成，以上檢驗過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.2 PTOA 病情評估 采用 X 線 ellgren&Lawrence分級標準，Ⅰ級：輕微骨贅；Ⅱ級：明顯骨贅，但未累及關節間隙；Ⅲ級：關節間隙中度變窄；Ⅳ級：關節間隙明顯變窄，軟骨下骨硬化。

1.4 觀察指標

（1）比較兩組軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表達量。（2）分析 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 鑒別診斷 PTOA、RA 的截斷值、靈敏度、特異度。（3）不同病情病人軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 及 膝 關 節 評 分 法（Knee society score，KSS）、美國特種 外科醫院（Hospital for special surgery，HSS）評分：KSS、HSS 評分滿分 100 分，分值與均膝關節功能呈正比。（4）分析 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 與 PTOA 病情程度的相關性。（5）分析 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表達量與 KSS、HSS 評分相關性。

2 結果

2.1 兩組軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表達量比較

PTOA 組軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA低于RA組（

P

＜0.05），見表2。

表2 兩組關節炎病人軟骨中MMP-1 mRNA、A2M mRNA表達量比較∕

2.2 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 對 PTOA、RA 鑒別診斷價值

ROC 分析顯示，MMP-1 mRNA+A2M mRNA 鑒別診斷 PTOA、RA 的 AUC 為 0.909，大于單一的 MMP-1 mRNA、A2M mRNA，靈敏度為 89.47%，特異度為 80.56%。見表3。

2.3 不同病情病人軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 及 KSS、HSS 評分

MMP-1 mRNA、隨病情分級增加呈逐漸升高趨勢 ，A2M mRNA 表 達 量 、KSS、HSS 評分呈下降趨勢（

P

＜0.05），見表4。

表4 不同創傷性關節炎病情病人軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 及 KSS、HSS 評分∕

2.4 MMP-1 mRNA、A2M mRNA與PTOA病情程度的關系

logistic 回歸分析顯示，MMP-1 mRNA、A2M mRNA 與 PTOA 病情程度顯著相關（

P

＜0.05），見表5。

2.5 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表達量與 KSS、HSS 評分相關性

Pearson 相關性分析 ，MMP-1mRNA 與 KSS、HSS 評分呈負相關（

r

= - 0.575、-0.541，均

P

＜0.05），A2M mRNA 表達量與 KSS、HSS評分呈正相關（

r

=0.592、0.610，均

P

＜0.05）。

表5 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 與創傷性關節炎（PTOA）病情程度的關系

3 討論

PTOA 好發于年輕人群，嚴重影響病人生活質量，且由于年輕人不適合行關節融合或置換術，給家庭、社會帶來較大負擔，故加強對 PTOA 的研究意義重大。

3.1 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 鑒別診斷PTOA、RA 的價值

RA 是與 PTOA 相似的一種關節疾病，兩者臨床特征相似，鑒別診斷存在一定難度。MMP-1 是基質金屬蛋白酶家族成員之一，A2M主要由肝臟等產生，具有廣譜蛋白酶抑制作用。但目前關于 MMP-1、A2M 在 RA、PTOA 中表達水平比較的報道較少。本研究結果顯示，PTOA 病人軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 低于 RA 病人，可能與 RA 病人基質金屬蛋白酶∕金屬蛋白酶組織抑制因子失衡嚴重有關。且 MMP-1 mRNA+A2M mRNA 鑒別 診 斷 PTOA、RA 的 AUC 為 0.909，大于單一的MMP-1 mRNA、A2M mRNA，靈敏度為 89.47%，特異度為 80.56%，呈現出較高價值，可為臨床鑒別診斷PTOA、RA 提供量化參考。

3.2 MMP-1 mRNA 在 PTOA 軟骨中表達及與病情的相關性

MMP-1 可降解細胞外基質中的膠原纖維和明膠，改變細胞的微環境，破壞細胞外基質，不利于損傷細胞的修復。本研究發現，MMP-1 mRNA 與 PTOA 病情程度、KSS、HSS 評分顯著相關，提示檢測 MMP-1 mRNA 表達可評估 PTOA 病人病情嚴重程度與關節功能。根據 Xu 等研究，MMP-1基因多態性與骨關節炎的發病密切相關。動物學研究表明，MMP-1 在 RA 大鼠模型中呈高表達，與病情的改善有關，支持本研究結論。PTOA 病人關節存在炎癥反應，誘導白介素-1、腫瘤壞死因子-α 等炎性因子，并介導細胞外基質過度降解，對軟骨細胞保護作用減弱，導致軟骨細胞受損、壞死，軟骨層變薄等退變現象，因此可引起疼痛、關節活動受限等癥狀體征，且 MMP-1 水平越高，基質金屬蛋白酶∕金屬蛋白酶組織抑制因子失衡越明顯，軟骨破壞越嚴重，故病人病情越嚴重。表明抑制 MMP-1 表達可能有助于 PTOA 病人病情及關節功能的改善。

表3 MMP-1 mRNA、A2M mRNA對PTOA、RA鑒別診斷的 ROC分析結果

3.3 A2M mRNA 在 PTOA 軟骨中表達及與病情的相關性

A2M 是血漿中分子量最大的蛋白質，能結合多種離子、分子、蛋白水解酶。本研究結果顯示，隨病情分級增加呈逐漸升高趨勢，A2M mRNA表達量呈下降趨勢，A2M mRNA 與 PTOA 病情程度、KSS、HSS 評分顯著相關 ，提示檢測 A2M 可 評 估PTOA 病人病情與關節功能。Li 等報道顯示，早期補充 A2M 能通過抑制膠原蛋白Ⅱ誘導的關節炎模型中的炎癥來減輕軟骨和骨骺損傷，從側面論證了本研究 A2M mRNA 表達量與 KSS、HSS 評分呈正相關的結論。Liu 等研究指出，下調軟骨細胞中miR-146b 的表達，可抑制白介素-1β 誘導的胱天蛋白酶活化和蛋白水解酶的表達，起到軟骨保護與抑制骨關節炎進展作用，采用螢光素酶報告基因測定證實，軟骨細胞中 A2M mRNA 是 miR-146b 的 靶 基因，提示調控 A2M mRNA 表達，可能為 PTOA 的保守治療提供一個潛在思路。分析其原因可能是，A2M能通過抑制 MMP-1 等基質金屬蛋白酶，保護細胞外基質，促進基質金屬蛋白酶∕金屬蛋白酶組織抑制因子動態平衡的恢復與軟骨細胞微環境的改善，防止軟骨細胞的破壞，故是 PTOA 病人病情的保護因素，與 KSS、HSS 評分呈正相關。本研究不足之處在于，納入病例數較少，可能會影響數據，且軟骨組織標本的采集具有一定創傷 ，仍需后續的進一步完善。

軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 可診斷鑒別PTOA、RA，并與 PTOA 病人病情、關節功能顯著相關 ，調 控 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表 達 可 能 為PTOA 的治療提供了一個潛在思路。