強氧化劑脫黑色素對免疫組化染色影響的評估

韓 雪，宋國新，唐錦玲，張煒明

黑色素瘤是臨床上較為常見的皮膚黏膜和色素膜惡性腫瘤，也是發病率增長最快的惡性腫瘤之一[1]。免疫組化染色是黑色素瘤病理學診斷常用的檢查方法。富含黑色素的瘤組織行免疫組化染色時，組織中沉積的大量黑色素與免疫組化陽性所顯示的DAB棕黃色顆粒互相干擾，影響結果判讀[2]。因此，這一類組織染色前通常需要進行氧化脫黑色素處理。本實驗在實踐中發現強氧化劑處理切片不僅會造成組織脫片，還易破壞組織內抗原，造成假陰性結果。本文采用3組不同染色法評估富含黑色素的黑色素瘤組織中常規檢測的4種抗原受氧化脫黑色素的影響程度，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2016～2018年南京醫科大學第一附屬醫院病理科存檔的黑色素瘤標本28例，每例均重新切片，經HE染色證實組織內含有大量棕黑色色素顆粒。選取HMB-45、S-100、Melan-A、Ki-67 4種抗體作為測試抗體。實驗使用的一抗、檸檬酸抗原修復液(pH 6.0)、鼠兔通用型MaxVision二抗、DAB顯色試劑盒、AEC顯色試劑盒均購自福州邁新公司。脫黑色素采用高錳酸鉀/草酸法：0.5%高錳酸鉀液，2%草酸液均為科室自配。

1.2 方法將組織連續切片14張，分為3組：(1)第1組切片不經氧化脫黑色素處理，直接行HE染色和常規免疫組化檢測，DAB顯色。(2)第2組切片經抗原修復后采用高錳酸鉀法氧化脫黑色素，再行HE染色和常規免疫組化檢測，經DAB顯色。脫黑色素方法如下：組織切片水洗，根據切片中黑色素量的多少，用強氧化劑高錳酸鉀液滴染5～30 min，蒸餾水沖洗；滴加2%草酸，鏡下觀察無色后流水沖洗，記錄氧化劑氧化時間。(3)第3組切片不經氧化脫黑色素處理，直接行常規免疫組化檢測，AEC顯色。

2 結果

2.1 脫黑色素后免疫組化染色抗原表達直接行HE染色的切片鏡下可見組織中含有大量的棕褐色顆粒(圖1)，脫黑色素后行HE染色，發現這些棕褐色顆粒消失，證實這些色素顆粒為黑色素。第1組切片的免疫組化染色正常，無脫片現象發生，DAB顯色的陽性結果呈棕色，與褐色的內源性黑色素相互干擾，難以準確判讀(圖2)。第2組切片內均無黑色素沉著(圖3)，經兩位高年資診斷醫師閱片，與第3組相比，HMB-45、S-100、Melan-A、Ki-67總表達減弱/假陰性率分別有60%(15/25)、16%(4/25)、88%(22/25)和24%(6/25)(表1)，其中Melan-A表達受氧化脫黑色素影響程度最高，22例表達減弱甚至陰性，HMB-45次之，25例Ki-67均出現不同程度背景著色。脫黑色素后行免疫組化染色的28例組織中，13例部分脫片，合計21張切片有不同程度的掉片，其中3例完全脫片無法繼續進行閱片故不納入后續統計。第3組切片AEC紅色顯色與黑色素區別明顯，與背景反差強，便于鏡下觀察(圖4)。

①②③④

表1 氧化脫黑色素對抗原表達的影響(n=25)

2.2 不同脫黑色素時間與抗原表達受影響的關系25例組織按高錳酸鉀氧化時間分為5 min組7例、6～15 min組13例和16～30 min組5例，各組切片4種抗原表達減弱/假陰性數及其所占本組的比例見表2，4種抗原受脫黑色素時間影響程度不一，16～30 min組受影響比例最高，6～15 min組受影響次之，5 min組受影響比例最低。大部分富含黑色素的組織經6～15 min高錳酸鉀氧化后，黑色素可被有效脫掉。

表2 不同脫黑色素時間組抗原表達減弱/假陰性例數[n(%)]

3 討論

黑色素是由黑色素母細胞產生的一種生物性色素顆粒，正常表達于人體表皮、虹膜、睫狀體和脈絡膜、腦膜和神經節等處，在常規HE染色中通常呈黃褐色或棕褐色[3]。組織切片中存在大量黑色素顆粒時，會掩蓋細胞的結構及形態，影響鏡下觀察和疾病診斷，從而需要進行脫黑色素處理，尤其在行免疫組化染色時，常規的DAB棕色顯色極易受黑色素干擾[2]。黑色素是一種不含鐵而含硫的色素，性質穩定，完全不溶于水及有機溶劑，常規組織經固定、脫水、透明、浸蠟后也不會丟失黑色素。目前對組織中內源性黑色素的脫黑色素試劑以氧化劑類為主，如高錳酸鉀等，利用氧化劑的氧化及漂白作用，打開黑色素的酚環，使之脫色[4]。現行使用較多的高錳酸鉀強氧化劑脫黑色素法脫黑色素效果好，時間短，但容易掉片，既往的研究多專注于試劑濃度、脫黑色素時間的優化上，較少關注脫黑色素過程中強氧化劑對組織切片中抗原的破壞。

作者在實踐中發現，部分組織經過脫黑色素處理后行常規免疫組化檢測時會出現抗原表達減弱甚至假陰性的現象，且假陰性的出現率與氧化劑脫黑色素時間的長短相關，即組織中含有的黑色素越多，需要脫黑色素的時間越長，對抗原的影響亦越大。同時氧化劑對抗原的影響具有選擇性[5]，即相同的氧化脫黑色素時間對不同抗原的影響程度不一致。在本組實驗中有25例黑色素瘤組織的4種常用診斷抗體均出現不同程度的抗原表達減弱/假陰性反應，Melan-A表達受氧化脫黑色素影響程度最高，HMB-45次之。隨著氧化劑脫黑色素時間的延長，還會出現細胞形態及結構的破壞，影響了抗原定位的準確性以及抗體與之反應的敏感性。

DAB顯色劑是免疫組化染色中最常用的顯色劑，顯色保存長久不褪色是其最大優點，但在富含黑色素的黑色素瘤組織中，黑色素顆粒干擾DAB棕黃色陽性顆粒，影響鏡下觀察。氧化脫黑色素雖能脫去組織中的黑色素，但對組織中的抗原產生影響，甚至影響判讀結果的準確性，因此，在富含黑色素的腫瘤組織行免疫組化檢測時可采用AEC顯色劑替代DAB顯色劑，取消了氧化脫黑色素環節，既避免了脫黑色素過程中強氧化劑對組織的損傷，又簡化了染色流程，且能取得良好的染色效果。此外，劉興華等[6]在免疫組化DAB顯色后使用H2O2去黑色素也取得較好的效果，陽性定位準確，表達清晰，提高了診斷的準確率。在日常工作中，仍需不斷摸索、不斷創新，尋找操作更加簡便、免疫組化結果更加優良的脫黑色素方法。