一種沉降式液基系統(tǒng)制片中加熱而不影響細(xì)胞形態(tài)的方法

宋以菊，任 翡，吳佳文，楊文韜，曾 歡，陳 穎，平 波

液基細(xì)胞制片技術(shù)(liquid-based cytology technology, LBC)指細(xì)胞學(xué)標(biāo)本收集至細(xì)胞保存液內(nèi)，經(jīng)過處理減少標(biāo)本中影響診斷的成分(黏液、血液、炎性滲出物等)后制成薄層細(xì)胞片，染色，由細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)師通過對分布于較小區(qū)域內(nèi)細(xì)胞的識別最后作出細(xì)胞學(xué)診斷。因其操作簡單，制片背景干凈，細(xì)胞均勻平鋪，染色質(zhì)量穩(wěn)定，閱片強度降低等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于子宮頸細(xì)胞學(xué)及胸腹水、痰、尿、肺泡灌洗液等非婦科細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域[1-4]。沉降式是LBC的主要代表之一，在沉降式LBC制片系統(tǒng)制片的上機過程中，細(xì)胞樣本的抽吸、轉(zhuǎn)移和染色等過程中均有可能形成氣溶膠[5-6]，若其中含有致病病原微生物，則易造成環(huán)境污染，并可能感染工作人員。加熱是一種常見的滅活病原微生物的方法，例如通過呼吸系統(tǒng)傳播的SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2等冠狀病毒，對熱敏感，56 ℃ 30 min可有效滅活。然而LBC制片過程中是否可增加加熱環(huán)節(jié)，并避免加熱對細(xì)胞形態(tài)造成的改變，尚未見文獻報道。本科室嘗試了將標(biāo)本經(jīng)細(xì)胞保存液固定，加入Tris緩沖液后置于60 ℃下加熱30 min再行沉降式LBC制片的方法，并檢驗此加熱方法對細(xì)胞形態(tài)和染色有無影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源收集2020年3～5月復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科細(xì)胞室診斷后剩余的非婦科標(biāo)本(胸腹水和甲狀腺細(xì)針穿刺)和子宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本。

1.2 實驗試劑及儀器沉降式LBC制片系統(tǒng)，程控離心機，漩渦振蕩器。LBC細(xì)胞保存液，蘇木精，細(xì)胞沉降管，移液吸頭，12 mL離心管和專用載玻片等。Tris緩沖液(pH 8.0)、伊紅、無水乙醇、二甲苯、中性樹膠、50 mL離心管、蓋玻片等。

1.3 沉降式LBC制片系統(tǒng)自動制片前標(biāo)本處理(圖1)。

圖1 LBC制片流程圖

1.3.1加熱前標(biāo)本處理 非婦科標(biāo)本：在生物安全柜中，將胸腹水45 mL置于50 mL離心管中，2 000 r/min離心10 min，將上清倒入安全柜中放有含氯消毒片的廢液桶中。向離心管中加入10 mL LBC細(xì)胞保存液，漩渦震蕩后靜置于生物安全柜中。甲狀腺細(xì)針穿刺標(biāo)本送至細(xì)胞室時已通過針頭洗滌轉(zhuǎn)移至細(xì)胞保存液中。標(biāo)本在細(xì)胞保存液中至少30 min，2 000 r/min離心10 min，棄上清留沉淀。沉淀中加入20 mL Tris緩沖液，漩渦震蕩重懸，均分為2份，每份10 mL于50 mL離心管中，分別標(biāo)記為加熱管和室溫管。

子宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本：從細(xì)胞保存瓶中轉(zhuǎn)移8 mL標(biāo)本至含有4 mL標(biāo)本密度分離液的12 mL離心管中，1 200 r/min離心2.5 min吸去離心管上層的血液和黏液等，將下層轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，2 000 r/min離心10 min，棄上清留沉淀。沉淀中加入20 mL Tris緩沖液，漩渦震蕩重懸，均分為2份，每份10 mL于50 mL離心管中，分別標(biāo)記為加熱管和室溫管。

1.3.2加熱處理 將加熱試管轉(zhuǎn)移至60 ℃烘箱中加熱30 min，漩渦震蕩重懸后，轉(zhuǎn)移至12 mL離心管，2 000 r/min離心10 min，棄上清取沉淀。

1.3.3室溫對照處理 室溫管置于生物安全柜內(nèi)，室溫放置30 min，漩渦震蕩重懸后，轉(zhuǎn)移至12 mL離心管，2 000 r/min離心10 min，棄上清取沉淀。

1.4 沉降式LBC制片系統(tǒng)自動制片取沉淀行沉降式LBC制片系統(tǒng)自動制片，非婦科標(biāo)本行HE染色，子宮頸標(biāo)本行巴氏染色，染色完畢后，無水乙醇清洗2次，二甲苯透明，自動封片機封片。

1.5 制片質(zhì)量評價由兩名高年資醫(yī)師及兩名高年資技術(shù)員鏡下共同觀察，共同評價液基細(xì)胞學(xué)涂片的色彩(細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)顏色對比及光學(xué)透明度)、細(xì)胞形狀、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核變化。觀察細(xì)胞類型：間皮細(xì)胞、組織細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、腺癌細(xì)胞、甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞以及正常子宮頸細(xì)胞。

2 結(jié)果

將加熱組與對照組的染色效果及細(xì)胞形態(tài)進行對比，發(fā)現(xiàn)加熱組與對照組制片的染色效果和細(xì)胞形態(tài)無區(qū)別。鏡下觀察非婦科標(biāo)本，HE染色紅藍分明，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)對比明顯，透明度好。兩組細(xì)胞邊界特征均能清楚顯現(xiàn)，如間皮細(xì)胞均可見“圍裙”樣表現(xiàn)及“開窗”現(xiàn)象(圖2A、B)。對于細(xì)胞質(zhì)豐富的細(xì)胞可見清晰的胞質(zhì)細(xì)節(jié)，如組織細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見空泡(圖2C、D)。細(xì)胞核細(xì)節(jié)展示清晰，如淋巴細(xì)胞的核膜可見小凹陷，中性粒細(xì)胞核分葉明顯(圖2E、F)，腺癌細(xì)胞核異型明顯，染色質(zhì)粗糙，可找及清晰的核分裂象(圖2G、H)，甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞顯示細(xì)胞核膜不規(guī)則，核溝及核內(nèi)包涵體均清晰可見(圖2I、J)。因此，加熱組在HE染色中無論是細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞質(zhì)細(xì)節(jié)和細(xì)胞核細(xì)節(jié)均與對照組無差異。

婦科標(biāo)本行巴氏染色，對照組和加熱組的鱗狀上皮和腺上皮細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，細(xì)胞平展，中間層細(xì)胞胞質(zhì)呈淺藍色，細(xì)胞核呈深藍色，染色質(zhì)細(xì)膩(圖2K、L)，表層細(xì)胞胞質(zhì)呈粉紅色，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞核呈紫色(圖2M、N)，頸管腺細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞核細(xì)膩可見小核仁(圖2O、P)。因此，加熱組對巴氏染色的婦科標(biāo)本在顏色的分色、細(xì)胞核的細(xì)節(jié)、細(xì)胞邊界等特征均無改變，不會對診斷造成影響。

對照組加熱組對照組加熱組ABCDEFGHIJKLMNOP

3 討論

在LBC說明書內(nèi)，廠商通常會明確寫出經(jīng)檢測細(xì)胞保存液可滅活的病原微生物，如常見的大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、結(jié)核桿菌和黑曲霉等，對于未經(jīng)檢測的其它致病因子無法保證全部滅活，故操作說明要求操作者將標(biāo)本視為有生物危害性，在整個操作過程中做好嚴(yán)格的防護措施。沉降式LBC制片設(shè)備尺寸較大，常常受環(huán)境限制，難以放入生物安全柜等密閉空間進行操作，因此尋找一種在上機前，既可以預(yù)防樣本中可能存在的傳染因子傳染又不影響制片質(zhì)量的方法非常重要。

上機前可能進行加熱的環(huán)節(jié)包括將含有標(biāo)本的細(xì)胞保存液加熱及緩沖液加熱。沉降式LBC細(xì)胞保存液可以對細(xì)胞學(xué)標(biāo)本起固定作用，經(jīng)固定后的細(xì)胞形態(tài)具有一定的穩(wěn)定性，不易改變。細(xì)胞保存液中含有醇類成分，且通常說明書建議使用溫度不得超過30 ℃，因此不能將細(xì)胞保存液進行加熱。Tris緩沖液為一種弱堿性緩沖液，在沉降式LBC制片系統(tǒng)制片過程中起到上機前標(biāo)本的清洗和染色過程中為細(xì)胞核染色提供弱堿性環(huán)境的作用。溫度會對Tris緩沖液的pH值有一定影響，在上機前清洗這一步加熱，后續(xù)離心后棄上清，加入新的緩沖液混勻轉(zhuǎn)移樣本，這段時間足以讓樣本恢復(fù)至室溫，故不會影響后續(xù)的染色過程。本組實驗通過比較加熱組與對照組的制片發(fā)現(xiàn)，加入Tris緩沖液后60 ℃加熱30 min，對細(xì)胞形態(tài)和染色無影響。

在沉降式LBC制片系統(tǒng)制片過程中，本實驗方法僅對加熱后樣本中的熱敏感性病毒起滅活作用，但是在此之前的細(xì)胞學(xué)操作包括轉(zhuǎn)移分裝樣本，離心、漩渦震蕩、傾倒上清、加細(xì)胞固定液等過程也都有可能形成氣溶膠，仍要采取嚴(yán)格的防護措施，如在生物安全柜內(nèi)操作，佩戴N95口罩、護目鏡，戴防護面具，穿防護服等[5-6]。