腫瘤出芽與pT1期胃腺癌臨床病理特征的相關性分析

徐 程，張 響，姬東澤，吳 靚，徐劉洋，張智弘

近年來對腫瘤的分子遺傳學研究日益精進，但組織病理學形態在判斷腫瘤性質、分化程度及評估患者預后方面仍有不可替代的作用。多項研究證實，腫瘤出芽(tumor budding, TB)是結直腸癌的不良預后因素，第8版AJCC指南、美國病理學家協會(College of American Pathologists, CAP)報告模板也提出，需在常規病理診斷中，對所有Ⅰ、Ⅱ期結直腸癌評估TB，評估方法及標準參照2016年國際TB會議共識(International Tumor Budding Consensus Conference, ITBCC)。然而，TB并非結直腸癌中的特有現象，其普遍存在于各種消化系統惡性腫瘤中，關于TB在胃癌(尤其是早期胃癌)中的意義尚不明確，本文收集232例pT1期胃癌，分析TB與其臨床病理特征的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料收集2013年1月～2015年1月江蘇省人民醫院/南京醫科大學第一附屬醫院病理學部明確診斷的pT1期胃腺癌(即腫瘤位于黏膜及黏膜下層)根治標本合計293例，剔除其中的低黏附性癌61例，最終納入研究的pT1期胃腺癌合計232例，所有病例均具有完整的臨床病理資料，包括患者性別、年齡、腫瘤最大徑、腫瘤分化、腫瘤浸潤層次、有無淋巴結轉移(入組要求取材淋巴結個數均在15枚以上)、有無脈管內癌栓，所有病例術前均未行放、化療或其他針對腫瘤的治療。所有標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，由兩名病理醫師獨立復習所有HE切片。通過電話或門診病歷系統對患者進行隨訪，本實驗觀察的預后指標為無進展生存時間(progression free survival, PFS)，即患者從手術日到出現復發、轉移、死亡的生存時間。

1.2 TB評估方法目前胃癌中TB尚無規范化的評估方法，本實驗基于ITBCC推薦的結直腸癌TB評估法評估胃癌TB，步驟如下：(1)根據目鏡的直徑計算該顯微鏡200倍視野的面積(本顯微鏡目鏡直徑22 mm，200倍視野直徑1.10 mm，面積0.95 mm2)。(2)從癌組織的所有HE切片中，選取在腫瘤浸潤前沿TB最豐富的一張切片；在100倍鏡下觀察該切片，尋找TB的熱點區(至少觀察10個100倍視野)。(3)選定熱點區后，轉到200倍視野，計數200倍視野下的TB數量。(4)根據不同顯微鏡直徑，計算每0.785 mm2的TB數，即TB數=不同目鏡實測TB數量/標化值(注：目鏡直徑20 mm的顯微鏡，200倍視野面積為0.785 mm2，其標化值為1，則本實驗選用顯微鏡標化值為1.210)。(5)將每0.785 mm2的TB數<5個定義為低級別TB，每0.785 mm2的TB數≥5個定義為高級別TB。

1.3 統計學分析采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。本實驗中患者年齡、腫瘤最大徑以中位數作為臨界值進行分組，TB與胃腺癌臨床病理特征的相關性分析采用Spearman秩相關性檢驗，多因素分析采用Logistic回歸，生存分析采用Kaplan-Meier函數，Log-rank檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征232例pT1期非低黏附性胃腺癌中，女性59例，男性173例；患者年齡33～86歲，中位年齡62歲；腫瘤最大徑0.3～6 cm，中位值2.0 cm；高分化19例，中分化143例，低分化70例；浸潤層次：黏膜內(pT1a)116例，黏膜下(pT1b)116例；無淋巴結轉移202例，有淋巴結轉移30例；無脈管內癌栓209例，有脈管內癌栓23例。16例患者術后接受化療(均為有淋巴結轉移的病例)，其余患者術后均未行化療。

2.2 TB的評估第一次閱片后，66例TB分級不確定，經重新切片及討論后再次閱片評估得出最終結果：232例pT1期非低黏附性胃腺癌中，低級別TB 196例(84.5%)(圖1)，高級別TB 36例(15.5%)(圖2)。

①②

2.3 TB與胃腺癌臨床病理特征的相關性高級別TB與女性患者(女性vs男性，r=-0.160，P=0.015)、腫瘤低分化(高+中分化vs低分化，r=0.263，P<0.001)、腫瘤浸潤至黏膜下層(黏膜內vs黏膜下，r=0.381，P<0.001)、有淋巴結轉移(無淋巴結轉移vs有淋巴結轉移，r=0.403，P<0.001)、有脈管內癌栓(無脈管內癌栓vs有脈管內癌栓，r=0.376，P<0.001)相關，與患者年齡、腫瘤最大徑無相關性(表1)。

表1 TB與胃腺癌臨床病理特征的相關性[n(%)]

2.4 TB與胃腺癌臨床病理特征的多因素分析將性別、腫瘤分化、腫瘤浸潤層次、有無淋巴結轉移、有無脈管內癌栓納入pT1期胃腺癌TB的多因素分析，結果顯示：腫瘤浸潤至黏膜下層(OR=17.192，P<0.001)、有淋巴結轉移(OR=3.976，P=0.011)、有脈管內癌栓(OR=3.521，P=0.033)是高級別TB的獨立危險因素，而性別、腫瘤分化非獨立危險因素(表2)。

表2 高級別TB(TB≥5)與胃腺癌臨床病理特征的多因素分析

2.5 淋巴結轉移與胃腺癌臨床病理特征的相關性淋巴結轉移與女性患者(女性vs男性，r=-0.306，P<0.001)、腫瘤低分化(高+中分化vs低分化，r=0.278，P<0.001)、腫瘤浸潤至黏膜下層(黏膜內vs黏膜下，r=0.206，P=0.002)、有脈管內癌栓(無脈管內癌栓vs有脈管內癌栓，r=0.302，P<0.001)、高級別TB(低級別vs高級別，r=0.403，P<0.001)相關，與患者年齡、腫瘤最大徑無明顯相關性(表3)。

表3 淋巴結轉移與胃腺癌臨床病理特征的相關性[n(%)]

2.6 淋巴結轉移與胃腺癌臨床病理特征的多因素分析將患者性別、腫瘤分化、腫瘤浸潤層次、有無脈管內癌栓、TB分級納入pT1期胃腺癌淋巴結轉移的多因素分析，結果顯示：女性(OR=0.138，P<0.001)，腫瘤低分化(OR=2.783，P=0.036)、高級別TB(OR=3.876，P=0.014)是淋巴結轉移的獨立危險因素，浸潤至黏膜下層和有脈管內癌栓非獨立危險因素(表4)。

表4 淋巴結轉移與胃腺癌臨床病理特征的多因素分析

2.7 生存分析本組177例患者獲得隨訪資料，隨訪時間7～85個月(中位隨訪時間69個月)，20例患者疾病發生進展(11.3%)，包括16例患者因腫瘤死亡，4例患者出現復發或轉移但目前尚存活，157例患者無進展生存(88.7%)。生存分析顯示，TB與pT1期胃腺癌患者的無進展生存期無明顯相關性(P>0.05)。

3 討論

TB定義為腫瘤間質內散在的單個或≤4個成簇的腫瘤細胞，廣義的TB分為腫瘤周圍出芽(peritumoral budding, PTB)和腫瘤內出芽(intratumoral budding, ITB)，PTB是指在腫瘤的浸潤前沿出現的TB，只能在手術標本中評估，ITB是指在腫瘤主體內出現的TB，在手術標本、活檢標本中均可評估[1]。盡管ITB在腫瘤的預后評估中有一定的價值，比如部分學者認為ITB與結直腸癌淋巴結轉移相關[2]，但目前國際上主流的研究認為，ITB提示不良預后的證據等級不如PTB充分，ITBCC目前尚不建議將ITB納入消化系統腫瘤的組織病理學評估中。大部分文獻報道的TB(包括本實驗)均特指PTB。

TB最早被發現與結直腸癌的侵襲、轉移密切相關：多個中心的研究均證實TB是pT1期結直腸癌淋巴結轉移的獨立相關因素[3-4]，最大樣本量的研究來自2015年日本Kawachi等[5]的研究，806例pT1期結直腸癌中，有233例存在高級別TB(29%)，25%高級別TB病例發生淋巴結轉移，僅7%低級別TB病例發生淋巴結轉移(P<0.001)。TB是Ⅱ期結直腸癌無進展生存期和總生存期的獨立預后因子。一個納入12項評估TB作為Ⅱ期結直腸癌預后因素的研究系統證明，高級別TB是重要的不良預后因素(P<0.001)，并可以作為病死率的獨立預測因子(P<0.001)[6]。基于TB對提示患者預后的重要價值，結直腸癌的CAP病理報告模板中，已將TB作為常規報告內容。

除了結直腸癌，越來越多的研究認為TB與胃癌、食管癌、胰腺癌等多種消化系統腫瘤的預后相關[3, 7-8]。在本實驗之前，針對胃癌TB的系統性研究主要有4項[9-12]，均認為高級別TB的病例具有更高的侵襲性(表5)。本組實驗結果顯示，高級別TB與更深的腫瘤浸潤層次、淋巴結轉移、脈管內癌栓相關，而這些病理參數均提示腫瘤的侵襲性和不良轉歸，與文獻報道相似。其中TB與淋巴結轉移的相關性尤其值得關注，對于內鏡下黏膜剝除術的早期胃癌標本，我們不僅要關注腫瘤距垂直切緣的距離，還應評估TB，從而預測其淋巴結轉移風險，成為是否需追加根治手術的重要依據。

表5 胃腺癌中TB的分析

Che等[9]、Olsen等[10]、Kemi等[11]在全部胃腺癌中的TB研究均顯示，高級別TB與較短的生存期相關，僅Gulluoglu等[12]的研究針對pT1期胃腺癌，但未做生存分析。本實驗預后分析結果顯示，TB與pT1期胃腺癌患者的無進展生存期無顯著相關性，其原因可能是高級別TB與淋巴結轉移顯著相關，而有淋巴結轉移的部分患者術后接受了化療，改善了預后，作者猜想，TB可協同淋巴結轉移，成為早期胃癌患者術后是否需要化療的參考依據。本組部分病例因失訪，可能干擾了生存分析結果，故pT1期胃腺癌中TB與預后的相關性需加大樣本量進行深入探究。

目前胃癌中的TB研究尚不如結腸癌深入，且無規范化的TB評估方法，以往的4項研究評估方法也各不相同，導致TB低級別、高級別的分級標準也未統一。本實驗與Kemi等[11]的研究參考了ITBCC推薦的結直腸癌“TB熱點區”評估法，即從所有切片中選取1個最熱點區域，計數該區域200倍視野下的TB數，該方法已形成共識，且相對簡單，不會給診斷工作造成負擔，建議推廣到胃癌的TB評估中。ITBCC比較了在HE切片中直接觀察和利用上皮免疫組化標記觀察TB，發現兩種方法對TB的判讀結果相似，且前者更加方便、經濟，也避免了上皮標記在壞死細胞中出現假陽性現象，故推薦病理醫師利用HE切片直接評估TB，但報告結果完全依賴于觀察者的經驗，需經過統一培訓來保證判讀的可重復性。

本組病例未將低黏附性癌納入其中，因為Olsen等[10]和Kemi等[11]的兩項研究均不推薦在低黏附性癌中評估TB，他們認為，低黏附性癌以單個散在腫瘤細胞的形式浸潤胃壁，難以明確何為腫瘤浸潤前緣，故無法準確評估TB，有學者認為，低黏附性癌可能是高級別TB的一種極端表現形式，即腫瘤完全由出芽的腫瘤細胞構成[3]，也可解釋為何低黏附性癌的侵襲性更強、預后更差。另外，目前對于其他一些特殊組織學亞型腺癌中TB的評估經驗有限，需十分謹慎，如在黏液腺癌中，漂浮在黏液湖里的腫瘤細胞簇不應視為TB；若腫瘤間質彌漫性炎細胞浸潤及促結締組織反應(尤其是在髓樣癌中)，有時很難觀察到其中的TB，此時可通過重新切片或上皮免疫組化標記輔助評估；新輔助化療后的標本不適合評估TB，故“TB無法評估”，并作出相應解釋，在病理診斷中可以接受[1]。

TB與上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關[13]：EMT是指上皮細胞轉化為梭形間質細胞的過程，是胚胎發育和傷口愈合所涉及的正常生理機制，過程中伴隨著上皮細胞間黏附蛋白的減少、并獲得促進細胞遷移的間葉表型[14]。在出芽的腫瘤細胞中，與細胞黏附能力相關的鈣黏蛋白E-cadherin、claudins、α-catenin、β-catenin等表達下調，而誘導EMT過程的重要間葉標記ZEB1、ZEB2、β-catenin、vimentin、SMA等顯著上調[13]。目前研究認為，TB模仿了EMT過程，使腫瘤獲得侵襲、轉移能力，從而解釋了高級別TB病例更易發生淋巴結轉移、預后也更差的原因。臨床工作中，可應用于證實TB的免疫標志物較少，目前獲得普遍認可且特異性較強的是E-cadherin膜陽性水平下調，β-catenin在腫瘤主體內呈細胞膜、質陽性，在浸潤前沿(即出芽的腫瘤細胞)中呈細胞核陽性。目前，通過阻斷EMT相關信號轉導通路中的各種受體(Axl、c-MET等)、酶(COX2、Erk2等)、轉運蛋白(LIV-1等)，研發出許多相關抑制劑，在抑制腫瘤的轉移、進展方面取得一定的治療效果[15]。而TB與EMT密切相關，提示EMT相關抑制劑可成為高級別TB病例的潛在治療靶點。

綜上所述，TB與pT1期非低黏附性胃腺癌淋巴結轉移、脈管內癌栓、浸潤層次顯著相關，是腫瘤侵襲性的重要指標；TB的評估方法建議采用ITBCC推薦的結直腸癌“TB熱點區評估法”；基于其重要的臨床病理價值，建議將其推廣到pT1期胃腺癌的常規診斷體系中。