苓桂術甘湯加味聯合卡托普利對慢性心力衰竭大鼠BNP、ET-1、Caspase-3水平影響的研究

張燕飛,張 博,陳蘇寧

(中國醫科大學附屬盛京醫院，遼寧 沈陽 110004)

慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)是一種繼發于左室功能障礙的臨床疾病，目前全世界有3700多萬心力衰竭患者,且逐年增多[1]，并對衛生服務產生巨大需求[2]。CHF臨床表現非常廣泛，如呼吸困難、乏力和體液潴留等，甚至危及生命。中醫無慢性心力衰竭之名，可歸屬“心悸”“胸痹”等范疇，基本病機是心氣不足，推動血液能力下降，氣虛血瘀，久病漸致CHF，氣虛血瘀型心衰在臨床中較常見[3]。《素問·痹論》云：“心痹者，脈不通，煩則心下鼓，暴上氣而喘”。西藥治療心衰有效，中藥能改善癥狀，且不良反應小，中西醫聯合治療能有效減輕患者的不適狀態，提高生存期望值。

B型鈉尿肽(B-type natriuretic peptide，BNP)在臨床中能準確地判斷心衰嚴重程度,具有較高的臨床診斷價值[4]。內皮素-1(Endothelin-1，ET-1)由內皮細胞及多種不同類型的細胞合成,對心臟損傷有較高的診斷價值。實驗中心力衰竭動物和心力衰竭患者血漿ET-1水平升高,與血流動力學和癥狀的嚴重程度呈正相關[5]。有研究表明,血漿ET-1水平與心衰患者的病死率有關[6]。Savoj等[7]認為ET-1可能是HF的重要預后指標,ET-1水平升高與心衰加重、右心室功能下降、肺動脈壓升高、左房容積指數升高有關[8]。ET-1被認為是心力衰竭的預測因子和預后指標[9]。在161例臨床研究中,心衰患者血清中BNP和ET-1均高表達,高血壓、低鈉血癥、高BNP、高ET-1是心血管不良事件的獨立危險因素,血清BNP、ET-1與心力衰竭患者心泵功能及心室重構密切相關,可作為評價預后的重要參考指標[10]。在心動過速誘發心力衰竭犬模型細胞凋亡的實驗中,心衰時半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cysteine aspartate specific protease 3,Caspase-3)基因表達增加[11]。

中醫藥治療CHF在癥狀改善、整體康復醫療、提高生活質量等方面具有一定優勢。吾師依據多年臨床經驗以苓桂術甘湯為基礎增加黃芪、丹參、赤芍三味藥，此方具有益氣活血、溫陽利水的功效。本實驗通過觀察比較不同干預條件下大鼠血清BNP、ET-1、Caspase-3水平的變化，研究苓桂術甘湯加味聯合卡托普利對心衰大鼠的作用和療效。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雄性SD大鼠60只，8周齡，體重180～220 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物許可證號[SYXK(遼)2017-0004]。本課題符合實驗動物倫理學標準，動物倫理編號2019PS430K。大鼠飼養于中國醫科大學附屬盛京醫院本溪研發中心SPF級動物房，恒溫恒濕、采光明暗交替12 h、無菌飼料專人喂養，適應性喂養1周后開始實驗。

1.1.2 主要試劑：鹽酸異丙腎上腺素注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號41190402)；卡托普利片(上海旭東海普藥業有限公司，批號PA180308)；ET-1、BNP、Caspase-3雙抗夾心酶聯反應試劑盒(上海酶聯生物有限公司，批號分別為20190626、20190718、20191022)；中性樹脂(中國上海標本模型廠，批號20170715)；0.9%氯化鈉注射液(華仁藥業股份有限公司，批號 Q1906060)。

1.1.3 主要儀器：顯微鏡 (型號 E800)；圖像采集軟件(版本NIS-Elements F3.0)；PowerLab生理記錄儀(型號Power Lab PL3508)；電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠，JJ323BC型)；彩色超聲診斷系統(Philips Ultrasound公司，型號iE33)；多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司，型號NS20150619016)。

1.2 實驗方法

1.2.1 苓桂術甘湯加味：茯苓、黃芪各20 g，桂枝、炙甘草各10 g，白術、丹參、赤芍各15 g。藥品由中國醫科大學附屬盛京醫院免煎藥房提供。

1.2.2 建模、分組及給藥：SPF雄性SD大鼠50只，隨機選取10只為正常組，剩余40只建立心衰大鼠模型，腹腔注射異丙腎上腺素，劑量為5 mg/(kg·d)，1次/d，連續7 d復制心衰模型[12]，1周后將造模成功大鼠按隨機數字表法分為心衰組10只、中藥組10只、西藥組10只、聯合組10只。根據《藥理實驗方法學》給藥劑量換算，大鼠給予劑量是人的6.3倍，西藥組給予2.5 mg/(kg·d)的卡托普利灌胃，中藥組給予3 g/(kg·d)的苓桂術甘湯加味灌胃，聯合組予等劑量卡托普利聯合等劑量苓桂術甘湯加味灌胃，心衰組和正常組給予等體積生理鹽水，以上各組均1次/d，連續4周灌胃。

1.2.3 心功能檢測：灌胃4周后，正常組與心衰組分別隨機抽取5只大鼠，多普勒彩色超聲檢測左室射血分數(Left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.2.4 病理形態學觀察：取大鼠左心室置于4%多聚甲醛溶液,4 ℃冰箱固定48 h,常規切片后將玻片放置于60 ℃烘烤箱中12 h,HE染色后用中性樹膠封片,晾干。通過電子顯微鏡拍照,采集分析組織相關部位。

1.2.5 BNP、ET-1、Caspase-3的水平檢測：灌胃4周后，10%水合氯醛麻醉大鼠，用5 ml注射器從腹主動脈采血。將血液置于4 ml的EP管中，室溫自然凝固2 h。低溫高速離心20 min，轉速為3000 r/min，取上清液，采用ELISA法進行測定。

1.2.6 心臟質量指數(Heart mass index,HMI)檢測：取心臟，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，用電子秤稱重，計算心臟質量指數。計算公式：HMI=心臟重量/總體重×100%。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠外觀狀態觀察 正常組大鼠一切如常，其余四組大鼠出現脫毛、呼吸喘促、腳部水腫、行動遲緩以及死亡。最終實驗處理前，心衰組死亡3只，西藥組死亡2只，中藥組死亡2只，聯合組無死亡。

2.2 各組大鼠心功能比較

2.2.1 正常組與心衰組心電圖比較：造模1周后，從正常組和心衰組中隨機抽取大鼠記錄其心電圖，觀察心率變化，心衰組R-R間期縮短，心率代償性增快(圖1)。

圖1 正常組與心衰組大鼠心電圖比較

2.2.2 各組大鼠LVEF、HMI比較：治療4周后,各給藥組大鼠的LVEF、HMI水平明顯優于心衰組,組間差異具有統計學意義(均P<0.05)，而給藥組之間兩兩比較，差異無統計學意義(均P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠LVEF、HMI水平比較

2.2.3 各組大鼠心肌細胞組織病理學：光鏡下觀察各組大鼠心肌細胞病理學情況(圖2)。正常組心肌纖維結構正常；心衰組心肌細胞肥大、肌纖維增厚、細胞核增大、排列紊亂，部分心肌細胞壞死、空泡變性，伴有不同程度的炎癥細胞浸潤。中藥組、西藥組、聯合組大鼠心肌纖維增厚、排列稍紊亂，伴輕度炎癥細胞浸潤。

圖2 各組大鼠心肌細胞組織病理學比較(HE染色，×200)

2.2.4 各組大鼠血清BNP、ET-1、Caspase-3水平比較：三組給藥大鼠治療后BNP、ET-1和Caspase-3水平均有所下降,各給藥組與心衰組比較，差異具有統計學意義(均P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清BNP、ET-1、Caspase-3水平比較

3 討 論

CHF是一種綜合征，不僅患病率高，而且預后差，已成為老年人死亡的主要原因之一。在我國古代醫學書籍中，心氣虛是心衰最基本的病機[13]。中藥在穩定病情、改善心臟功能、提高生活質量等方面具有明顯的優勢，臨床多采取益氣活血，溫陽利水消腫的治療原則，療效較好[14-15]。苓桂術甘湯加味由吾師多年經驗而來，本研究旨在驗證苓桂術甘湯加味對心衰大鼠BNP、ET-1、Caspase-3指標的影響，為臨床用藥提供依據。

ET-1前體分子在合成ET-1過程中產生的血漿ET-1及其相關肽的循環水平作為心血管事件的潛在危險標志物已被廣泛研究。ET-1在調節血管張力中起關鍵作用，并可誘導心肌細胞肥大、成纖維細胞增殖和纖維化。ET-1的作用是通過細胞表面受體的參與，導致細胞內通路激活，從而使血管收縮，平滑肌細胞增殖,與心衰嚴重程度呈正相關[16]。冠心病患者ET-1水平高于健康人，ET-1水平與疾病嚴重程度及心臟功能密切相關[17]。Bossard等[18]研究發現ET-1的表達水平不僅與CHF有關，還與急性心力衰竭、冠心病等心血管疾病有關。Horckmans等[19]在大鼠模型上進行了實驗，并認為ET-1水平降低與微血管通透性降低、中性粒細胞浸潤和內皮細胞黏附分子表達減少有關。ET-1與衰老、血壓、肺功能和慢性腎臟疾病的關系，以及ET-1水平與心臟重構(包括左心房直徑增加和左心室質量增加)相關的證據已被描述。ET-1被認為是心力衰竭的預測因子和預后指標。Caspase-3是細胞凋亡的重要基因之一。有研究顯示，TAC小鼠心肌中的Catenin表達水平顯著升高，相應的，促凋亡蛋白即Caspase-3和Bax的表達水平顯著升高，Caspase和Bcl-2家族蛋白是凋亡通路的關鍵因素，Caspase-3是參與細胞凋亡的主要Caspases之一，Caspase-3在心肌細胞凋亡中起重要作用[20]。

通過本實驗可以得出，苓桂術甘湯加味聯合卡托普利可以明顯逆轉慢性心力衰竭大鼠心臟充血、水腫等肉眼改變，減少心肌病理結構的異常改變，降低血清BNP、ET-1、Caspase-3水平，提高LVEF水平，改善心衰大鼠的生活狀態，進而為臨床用藥提供科學依據。