基于網絡藥理學探究清熱解毒與補氣養血中藥配伍對骨髓炎的分子作用機制

時永健,杜全紅,隋明軍,隋海明

(1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250035；2.山東省文登整骨醫院，山東 威海 264400)

骨髓炎是一種由化膿性細菌感染骨髓、骨皮質及骨膜等引起的慢性感染性疾病，常會造成周圍軟組織潰爛壞死[1]。多數由糖尿病足及血源性骨感染引起，但近年來隨著墜落傷、交通傷等高能量損傷發生率增加,骨髓炎已成為開放性骨折、內固定手術的常見并發癥[2]。慢性骨髓炎往往反復發作,遷延難愈,急性發作常引起高熱、局部疼痛，若診治不及時也會轉為慢性，并造成局部肌肉萎縮、關節僵硬等,必要時不得不做出截肢保命的選擇，嚴重影響患者生活質量，給家庭及社會造成沉重的經濟負擔[3]。因此，尋找治療骨髓炎的有效藥物、途徑迫在眉睫。隨著中醫藥的不斷發展，越來越多的研究著眼于骨感染治療，并取得一定的臨床療效。有報道顯示，常規抗菌藥物聯合中藥能產生協同作用，有效抑制多重耐藥菌[4]。

骨髓炎在中醫屬“附骨疽”范疇,其病機為濕熱之毒結聚于骨，或病后余毒未清，濕熱內盛，化為深部膿瘍，熱毒注骨,正虛邪侵為其主要病機[5-6]。多項數據挖掘研究發現，中藥治療骨髓炎中當歸、黃芪、甘草、金銀花使用頻率最高[7-8]。當歸補血活血，為補血之圣藥；黃芪補氣升陽、托毒生肌，為補中益氣要藥；甘草補氣、緩急止痛、清熱解毒；金銀花清熱解毒，為治熱毒所致癰瘡之要藥。四藥共奏清熱解毒、補氣活血之功,符合消、托、補治法，在清熱解毒之時又補氣養血，顧護正氣。鑒于此，本研究利用網絡藥理學相關技術探究當歸、黃芪、甘草、金銀花配伍治療骨髓炎過程中可能存在的分子作用機制，為探索中藥組方治療骨髓炎提供思路與方法。

1 資料與方法

1.1 研究資料 本研究涉及的數據來源及運算平臺主要是中藥系統藥理學技術平臺(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)、Pub Chem數據庫、Swiss Target Prediction數據庫、Drug Bank數據庫、Uniprot數據庫、疾病基因數據庫、人類基因數據庫人類孟德爾遺傳綜合數據庫、綜合型藥物數據庫、治療靶標數據庫以及基因功能注釋數據庫。

1.2 研究方法

1.2.1 中藥活性成分及靶點篩選：依據TCMSP獲取當歸、黃芪、甘草、金銀花符合參數標準(500≥MW≥180、AlogP<5、Caco-2>-0.4、OB≥30%、DL≥0.18)的活性成分，并通過PubChem數據庫保存對應SMILES及2D結構。將所得結構導入Swiss target prediction及Drugbank數據庫進行靶點預測，取0.85相似性閾值及人類基因型為篩查條件。經Uniprot數據庫轉換基因名稱去重整合后，利用 Cytoscape 3.7.2軟件構建散活性成分-靶點作用網絡。

1.2.2 骨髓炎靶點篩選：以“Osteomyelitis”作為關鍵詞，采用疾病基因數據庫、人類基因數據庫、人類孟德爾遺傳綜合數據庫、綜合型藥物數據庫以及治療靶標數據庫對UF已知靶基因進行檢索與篩選，合并各數據庫的疾病靶基因。

1.2.3 網絡構建、映射分析：將所篩選的中藥潛在靶基因與骨髓炎靶基因交叉生成Venny圖，得出中藥治療骨髓炎的映射靶基因，借助String數據庫構建關鍵靶點，相互作用PPI網絡圖，并根據節點連接度(degree)值的大小進行篩選，得到核心靶基因。

1.2.4 關鍵靶點富集分析、通路分析：將篩選出的核心靶基因導入基因功能注釋數據庫，進行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析以及GO(Gene ontology，GO)生物過程的富集分析。以P≤0.05為篩選標準，分別將篩選出的前20個GO條目與KEGG條目借助Omic Share云平臺繪制富集分析氣泡圖。

2 結 果

2.1 藥物與疾病的靶基因 經TCMSP數據庫篩選出17個活性成分，具有161個靶基因(圖1)。經相關疾病數據庫搜索查重后共選出140個骨髓炎已知靶基因，映射出關鍵靶點127個。

圖1 藥物活性物質靶點圖

2.2 藥物與疾病的核心靶基因 經String數據庫在0.4中信度下生成相互作用PPI網絡(圖2)，其中127個節點之間共有666條相互作用關系，平均自由度為11.6，以degree值≥23篩選到核心靶點13個(圖3)。

圖2 關鍵靶點相互作用PPI網絡圖

圖3 核心靶點圖

2.3 前20個生物過程及信號通路 經David數據庫獲得126項GO富集結果及42條KEGG信號通路，以P值升序排列，分別篩選出符合條件的20個生物過程和信號通路，并將其以氣泡圖的形式展現出來(圖4、5)。通路下所含靶點，見表1。

表1 KEGG通路下所含靶基因

圖4 GO富集分析氣泡圖

圖5 KEGG通路分析氣泡圖

3 討 論

通過TCMSP平臺分析得出，槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、異鼠李素等可能是黃芪、當歸、甘草、金銀花治療骨髓炎的有效成分。骨髓炎紅、腫、熱、痛等臨床癥狀均是炎癥的局部反應，而上述活性物質在炎癥反應中均有獨特生物特性。槲皮素最突出的生理作用是抗炎[9]；現代藥理學研究發現槲皮素具有較強抑菌作用，并對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等有抑制作用，廣譜抗菌及不易耐藥成為槲皮素特質[10]。木犀草素的多種藥理活性也被證實與抗炎有關[11]，木犀草素一方面控制體內炎癥因子和炎癥介質分泌，另一方面木犀草素還可抑制炎癥位置活性氧的產生并活化相關抗氧化酶，改善氧化應激的進一步損傷。山奈酚通過調控促炎酶活性和炎癥相關基因的表達下調相關轉錄因子、MMP等，達到治療炎性疾病的目的[12]。β-谷甾醇作為常見的植物甾醇之一，同樣具有良好抗炎、抗氧化、免疫調節的生理作用。有研究發現β-谷甾醇能夠減少NO的合成,抑制巨噬細胞IL-6活性,下調IL-1、TNF等炎癥因子分泌[13]。體外實驗同樣發現，β-谷甾醇除選擇性抑制外，還可通過抑制IL-6和TNF發揮抗炎作用[14]。隨著研究的不斷深入，在各組織、器官、系統中的抗炎作用正在不斷被發現。異鼠李素通過有效抑制LPS，刺激炎癥因子MCP-1、IL-6、TNF-α的釋放；并作用于微生物細胞膜，從而影響相關蛋白酶[15-16]。由此可見，黃芪、當歸、甘草、金銀花四味中藥多種活性物質在抗炎方面發揮著巨大作用。

經靶點映射發現關鍵靶點占骨髓炎潛在靶點的91%，說明黃芪、當歸、甘草、金銀花與骨髓炎具有密切聯系，其活性成分能夠作用于骨髓炎絕大部分的治療靶點，AKT1、EGFR、HSP90AA1、SRC、ESR1等具有較高自由度，可能是治療骨髓炎的關鍵所在，黃芪、當歸、甘草、金銀花除清熱解毒，降低炎癥反應外，還有其他生理作用干預骨髓炎進程。成骨細胞的凋亡在骨髓炎中起關鍵作用[17]，而AKT1具有調節成骨細胞成熟分化的作用；此外AKT1還可以誘導軟骨內骨血管生成和骨化[18]，因而具有修復軟骨能力。EGFR除參與炎癥反應外，同樣可以通過級聯反應進一步促進血管生成與構建，并且廣泛表達于人的表皮細胞，具有表皮組織修復作用[19]。炎癥是氧化應激損傷表現方式之一,HSP90AA1是一種在遺傳中高度保守的伴侶蛋白分子,在保護細胞氧化應激損傷中具有重要作用[20]。SRC對于成骨細胞遷移具有重要作用，有研究顯示T3能夠通過SRC激活PI3K-Akt信號通路，發揮特異性成骨作用[21]。ESR1能夠促進成骨細胞增殖分化、抑制破骨細胞，因而對骨髓炎具有骨生成作用[22]。當然ESR1的轉錄活性是在核受體輔助因子調控下進行的，而SRC可以提高轉錄活性，活化核受體調節骨代謝[23-24]。眾多靶點通過復雜的協同作用，依據多條通路調控骨髓炎發展過程，由此可見黃芪、當歸、甘草、金銀花清熱解毒、補氣養血的功效，不僅能改善炎癥反應，同時能促進骨形成、骨修復以及血管生成、改善血運等。

通過基因可視化分析發現眾多靶點主要涉及一氧化氮生物合成過程的正調控、一氧化氮合酶調節劑活性、蛋白質對細胞核定位的正調控、ATP結合等多方面生物過程。核心靶點KEGG富集分析進一步揭示了黃芪、當歸、甘草、金銀花通過多條通路干預骨髓炎。其中，雌激素通路對促進成骨尤為重要，雌激素通過改善氧化應激水平抑制成骨細胞凋亡，誘導成骨細胞的增殖與礦化[25]。此外，雌激素結合受體后還可以抑制破骨細胞活性和增殖，加速凋亡作用，進一步促進骨生成[26]。研究表明，雌激素缺乏可引起相關促炎因子表達，其機制可能與雌激素缺乏對促炎因子的mRNA表達抑制作用減弱有關[27]。前列腺癌與骨代謝有關，前列腺癌往往伴隨雄激素、睪酮的分泌下降，而雄激素、睪酮與雌激素同樣在骨骼的成長發育過程中起著重要調節作用。陳曉英等[28]研究發現睪酮水平可調節炎癥因子水平；相關研究進一步證明降低睪酮水平可顯著降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平[29]。黏著斑信號通路可調控細胞黏附、生長及分化等多種生物過程，在生理活動中起重要作用。FAK是集中在黏著斑附近的一種激酶，參與多條轉導通路，大量數據證實FAK能夠調節細胞遷移和血管生成。FAK參與調節相關成骨通路的下游分子，特異性加強相關因子的表達，促進成骨分化，治療骨缺損[30]。RAP1信號通路與細胞分化、黏附有關，有研究發現RAP1和VE能相互影響,協同調控內皮細胞的反應和血管壁的功能，改善血運，增加血管通透性[31]。成骨液誘導MC3T3-E1成骨細胞時，隨誘導時間延長,Raplb表達量相應上調,因此Raplb參與了成骨細胞早期分化。甲狀腺激素通路可影響成骨及破骨細胞的增殖、分化，調控OP。過高的甲狀腺激素水平會上調4-HNE表達，而4-HNE可以通過IRAK1和TRAF6介導的炎癥反應機制激活炎性通路，增強炎癥反應，提高氧化應激水平。核心靶點富集出了大量通路，可見黃芪、當歸、甘草、金銀花對于骨髓炎的復雜調控過程。

本文從數據挖掘角度，分析中藥治療骨髓炎的處方規律，運用網絡藥理學相關方法從分子、通路方面分析清熱解毒、補氣養血相伍在骨髓炎中的治療機制，為今后研究提供了新的方向。