預處理方式對米糠酵素品質的影響

董欣睿，趙鑫磊, ，楊崳茜，江連州，于殿宇，包怡紅,3,

（1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030；3.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040）

米糠是稻谷碾磨加工形成精米過程中留下的種皮和胚芽的混合物質，是稻谷加工過程中的主要副產物之一，占稻谷總質量的5%～8%[1]。米糠含有多種營養物質及功能性化合物，其中粗蛋白質含量為11%～13%，纖維含量約為11%，油脂含量約為20%，還含有多種礦物質，如鐵、磷、鎂等[2-3]。有研究表明米糠油具有降低低密度脂蛋白和總血清膽固醇的功效[4]。米糠多用于化肥、動物飼料生產以及化妝品行業。目前，很多學者將米糠作為發酵底物，通過微生物代謝活動產生更多對人體有益的化合物，例如酶、抗氧化劑、生物表面活性劑、有機酸、多不飽和脂肪酸（PUFA）等，進而提高營養物質總含量[5-6]。

酵素一詞起源于日本，本意指酶，隨著酵素食品種類的增多，其含義延伸為植物通過接種乳酸菌或酵母菌進行發酵所獲得的發酵食品。酵素包涵有機酸、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶等多種活性成分，具有抗氧化、抑菌、凈化血液、消炎、促進細胞新生等作用[7]。米糠中含有豐富的多糖及脂肪酸，但其無法直接食用，因此發酵制備米糠酵素成為利用米糠的新途徑[2]。

超聲、微波、焙烤是常見的食品處理技術，三者分別通過空化作用、微波震蕩生熱、焙烤熱效應對物質結構或組成產生影響。王振斌等[8]利用超聲波輔助多菌種發酵技術制備葛根酵素，提高酵素中蛋白酶與脂肪酶活力，而尚未見微波與焙烤對酵素品質影響的文獻。目前，關于三種預處理方式對米糠酵素品質的影響鮮有報道。pH可反映發酵液中微生物生長代謝情況，液態酵素的pH一般在3～4之間[9]，因此，pH可作為判斷發酵是否正常進行的參考指標。由于米糠酵素中蛋白酶的存在，可以水解米糠蛋白生成一定量的L-谷氨酸，L-谷氨酸再經乳酸菌、酵母代謝產生的L-谷氨酸脫羧酶催化轉化為GABA，而GABA因其多種生理功能成為植物酵素質量品質的主要標志物之一，并可作為衡量酵素成熟度的主要指標。因此，本文以米糠為原料，經預實驗篩選確定的乳酸菌和酵母菌為發酵菌種，γ-氨基丁酸（GABA）含量和pH作為檢測指標，首先通過正交試驗獲得制備米糠酵素最優條件；然后通過單因素實驗分別優化不同預處理方式的工藝條件，最后各自在最優處理參數下，比較不同預處理方式對米糠酵素的影響，以期為米糠酵素的制備工藝及米糠資源的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米糠、γ-氨基丁酸、蜂蜜、乳酸菌（植物乳桿菌Lactobacillus plantarum） 東北林業大食品微生物實驗室保存；酵母菌（釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae）安琪酵母股份有限公司。

H/T20MM型臺式高速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；722型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；DH6000A型電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司；pHS-3E型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米糠酵素制備工藝流程

1.2.2 培養基配制

1.2.2.1 種子培養基 MRS（g/L）：蛋白胨10 g，牛肉浸粉5.0 g，酵母浸粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，七水磷酸氫二鉀2.0 g，三水醋酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，七水硫酸鎂0.2 g，四水硫酸錳0.05 g，溶于1000 mL蒸餾水中，調pH 6.2±0.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。YPD（g/L）: 10 g酵母膏，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖，溶于1000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.2.2 發酵培養基 將米糠與蒸餾水按料水比1:15（g/mL）混勻，煮沸90 min，5000 r/min離心10 min后取上清液，每50 mL發酵液中添加2.5 g紅糖和1.5 g蜂蜜，調pH至6.0，121 ℃滅菌20 min，得米糠發酵液備用。

1.2.3 米糠發酵工藝單因素實驗1.2.3.1 發酵時間對米糠酵素GABA含量及pH的影響 在發酵培養基中接入3%復合發酵菌種（植物乳桿菌與釀酒酵母體積比為1:1；植物乳桿菌約為1.1 ×109CFU/mL，釀酒酵母約為1.5×107CFU/mL），在28 ℃的溫度下分別靜置培養12、24、36、48、60 h，測定GABA含量及pH的變化。

1.2.3.2 發酵溫度對米糠酵素GABA含量及pH的影響 在發酵培養基中接入3%復合發酵菌種（植物乳桿菌與釀酒酵母體積比為1:1；植物乳桿菌約為1.1×109CFU/mL，釀酒酵母約為1.5×107CFU/mL），分別在28、30、32、34、36 ℃條件下靜置培養24 h后，測定GABA含量及pH的變化。

1.2.3.3 植物乳桿菌與釀酒酵母接種體積比對米糠酵素GABA含量及pH的影響 配制米糠酵素培養基，接種3%復合發酵菌種（植物乳桿菌約為1.1 × 109CFU/mL，釀酒酵母約為1.5×107CFU/mL），如表1所示，分別向發酵液中接入不同比例的乳桿菌與酵母，在溫度為28 ℃的條件下靜置培養24 h，測定GABA含量及pH的變化。

表1 植物乳桿菌與釀酒酵母接種體積比Table 1 Inoculation volume ratio of Lactobacillus plantarum and Saccharomyces cerevisiae

1.2.4 正交試驗 為得到制備米糠酵素的最優發酵工藝，在單因素實驗基礎上，選擇發酵時間（h）、發酵溫度（℃）、植物乳桿菌與釀酒酵母接種比例3個因素，以米糠酵素中GABA含量為評價指標，采用L9（34）正交試驗確定最佳發酵工藝條件，正交試驗因素水平表如表2。

表2 發酵條件優化的正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels table of optimization for fermentation conditions

1.2.5 預處理米糠的方法

1.2.5.1 超聲預處理米糠的條件 分別在超聲功率為180、210、240、270、300 W條件下（此時超聲時間為20 min），超聲時間為5、10、15、20、25 min（超聲功率為240 W），超聲處理后的米糠配制發酵培養基，將乳桿菌與酵母按照1:2比例接入發酵液，在30 ℃下培養24 h，測其GABA含量和pH。

1.2.5.2 微波預處理米糠的條件 對米糠原料進行微波預處理，微波功率設為300、400、500、600、700 W（此時微波時間為60 s），微波時間30、60、90、120、150 s（此時微波功率為600 W），微波處理后的米糠配制發酵培養基，將乳桿菌與酵母按照1:2比例接入發酵液，在30 ℃下培養24 h,測其GABA含量和pH。

1.2.5.3 焙烤預處理米糠的條件 對米糠原料進行焙烤預處理，焙烤溫度設為180、190、200、210、220 ℃（此時焙烤時間為15 min），焙烤時間為5、15、25、35、45 min（焙烤溫度為210 ℃），焙烤處理后的米糠配制發酵培養基，將乳桿菌與酵母按1:2比例接入發酵液，在30 ℃下培養24 h，測其GABA含量和pH。

1.2.6 γ-氨基丁酸的檢測 參考趙宏飛[10]等檢測γ-氨基丁酸的方法。

1.2.7 谷胱甘肽檢測 參考賈貞[11]檢測谷胱甘肽的方法。

1.2.8 pH檢測 采用pH計測定發酵液的pH,按照說明書操作。

1.2.9 蛋白酶檢測 參考楊旭等[12]等方法測定米糠酵素中蛋白酶活力。

1.2.10 乳酸菌菌落數的測定 參照GB 4789.35-2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[13]方法，用10倍稀釋法，將體積分數分別為10-2～10-8稀釋菌液涂布于MRS培養基上，37 ℃培養48 h后計數。

1.2.11 酵母菌菌落數的測定 參照GB 4789.15-2016 《食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》[14]方法，用10倍稀釋法，將體積分數分別為10-2～10-7稀釋菌液涂布于YPD培養基上，28 ℃培養48 h后計數。

1.3 數據處理

所有試驗平行測定3次，運用SPSS18.0與Graphpad Prism 7.0軟件進行數據的統計分析以及相關圖表的繪制。

2 結果與分析

2.1 米糠發酵條件單因素實驗結果

2.1.1 發酵時間對米糠發酵的影響 圖1可知，不同發酵時間對應的發酵液pH均在3.43～3.71范圍內，且在發酵時間12～60 h范圍內，pH呈現逐漸降低趨勢。當發酵時間為12 h時，米糠酵素中GABA含量為0.93 g/L；隨著發酵時間延長，酶產物的增加，當發酵時間為24 h時，米糠酵素中GABA含量達到最大0.95 g/L。隨著發酵繼續進行，相關酶的活性受到體系各因素的影響（如米糠培養基底物消耗）而降低[15]，導致米糠酵素中GABA含量降低。

2.1.2 發酵溫度對米糠發酵的影響 從圖2可知，實驗溫度范圍內，發酵24 h，發酵液pH在3.41～3.69之間，發酵溫度從28 ℃升高到30 ℃時，pH下降較快，超過30 ℃以后pH下降緩慢，當達到34 ℃還略有上升。米糠酵素中GABA含量隨溫度升高，呈先上升后降低的趨勢。當發酵溫度升高至30 ℃時，米糠酵素中GABA含量達到最大值為0.88 g/L，隨后GABA含量降低。胡超等[16]用高產GABA的酵母發酵生產GABA的最適溫度也是30 ℃，溫度偏低或者偏高對菌株的生長和代謝會有影響，從而影響GABA的產量及發酵液pH。

圖1 發酵時間對米糠酵素產γ-氨基丁酸與pH的影響Fig.1 Effect of fermentation time on GABA and pH of rice bran ferment

圖2 發酵溫度對米糠酵素產γ-氨基丁酸與pH的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on GABA and pH of rice bran ferment

2.1.3 植物乳桿菌與釀酒酵母接種比例對米糠發酵的影響 如表3所示，當發酵培養基中只接種乳酸菌或者酵母菌時，米糠酵素中GABA含量均不如混菌發酵時產量高，且pH均在3.5左右，因此混菌發酵要好于單菌發酵。當乳酸菌與酵母菌接種比例為1:2時（6號組），米糠酵素中GABA含量最高，為1.17 g/L。張旭普等[17]研究發現，植物乳桿菌與釀酒酵母混合發酵相比于單菌發酵在菌體代謝方面更有潛力，這可能是由于兩種菌的代謝產物在一定生長階段存在某種互生關系，同時也有相關釀酒酵母及乳酸協同發酵研究佐證[18-19]。

表3 不同接種比例米糠酵素中GABA含量及pH檢測結果Table 3 Detection results of GABA and pH in rice bran ferment with different inoculation ratios

2.2 米糠酵素發酵條件正交實驗優化結果

在單因素實驗基礎上，選擇發酵時間（A）、發酵溫度（B）、乳酸菌與酵母接種體積比（C）三個因素，以發酵液中GABA含量為評價指標，確定制備米糠酵素的最優發酵工藝條件。

米糠酵素發酵工藝的正交試驗結果見表4，方差分析結果見表5。由表5可知，三個因素對GABA產量影響的極差順序大小為B＞A＞C，方差分析表明，發酵溫度對米糠酵素發酵具有顯著影響（P＜0.05），發酵時間和乳酸菌與酵母菌接種比對發酵無顯著影響（P＞0.05）。直觀分析可知，最優發酵工藝條件為A2B2C2，即發酵溫度為30 ℃，發酵時間為24 h，乳酸菌與酵母菌接種比為1:2，但此工藝條件不在正交表的9組實驗中，需對正交試驗優化結果進行驗證。

表4 米糠酵素發酵工藝條件優化正交試驗結果（n = 3）Table 4 Result of orthogonal test for rice bran ferment fermentation conditions optimization (n = 3)

表5 以米糠酵素中GABA含量為評價指標的方差分析Table 5 Analysis of variance using GABA content in rice bran ferment as an evaluation index

2.3 發酵工藝驗證試驗

為驗證正交試驗優化結果的準確性，以發酵溫度30 ℃，發酵時間24 h，乳酸菌與酵母菌接種比為1:2時，測得GABA含量為1.41 g/L，此GABA產量高于正交表9組實驗中的最優實驗組（第5組A2B2C3結果為1.21 g/L）。因此，米糠酵素最優發酵工藝為發酵溫度為30 ℃，發酵時間為24 h，乳酸菌與酵母菌接種比為1:2。

2.4 米糠預處理工藝條件對酵素的影響

2.4.1 超聲預處理條件對米糠酵素的影響 由圖3可知，米糠酵素中GABA產量會隨著超聲功率的增大呈現先升高后降低的趨勢，而pH呈現先降低后升高的趨勢。在超聲功率為240 W時，GABA產量達到最大值為2.61 g/L，此時pH為最低值3.18（圖3a）。米糠酵素中GABA產量與pH隨著超聲時間延長所呈現趨勢與超聲功率增大的趨勢相同，當超聲時間為20 min時，GABA產量達到最大值2.59 g/L，此時發酵液pH為3.14（圖3b）。因此，超聲米糠的條件為超聲功率240 W，超聲時間20 min。超聲處理后的米糠經發酵制得米糠酵素GABA含量（2.61 g/L）高于未處理的米糠（1.41 g/L），分析其原因可能是由于超聲波的空化作用改變了米糠蛋白的四級結構，生成小分子的亞基和肽[20]，當發酵液中有蛋白酶產生時，促進米糠蛋白水解，從而影響米糠酵素中pH及GABA產量。

2.4.2 微波預處理條件對米糠酵素的影響 由圖4可知，當微波功率為300 W時，米糠酵素中GABA產量為1.08 g/L，pH為3.56。當微波功率增大至600 W時，GABA產量達到最大值1.47 g/L，pH為3.36。隨著微波功率繼續增大，GABA產量有降低趨勢，pH變化不明顯（圖4a）。GABA產量隨著微波時間延長呈現先升高后降低的趨勢，而pH呈現先降低后升高的變化趨勢。當微波時間為60 s時，GABA產量達到最大值1.45 g/L，此時發酵液pH為3.32（圖4b）。因此，微波處理米糠的條件為微波功率600 W，超聲時間60 s。經微波米糠制得的米糠酵素GABA含量（1.47 g/L）大于未經處理的米糠酵素中GABA（1.41 g/L）含量，因為微波使米糠蛋白的空間結構受到破壞，蛋白二級結構螺旋和折疊發生變化，從而增加米糠蛋白溶解性，進而提高發酵液中GABA的產量[21]。然而，微波功率過大及微波時間過長，微波的熱作用使蛋白質的球形結構變為棒狀結構, 疏水基團暴露, 疏水殘基相互作用形成網絡, 又會使蛋白的溶解性降低，不利于發酵菌種利用，因此pH會呈現先降低后升高的趨勢[22]。

圖3 超聲預處理米糠對米糠酵素產γ-氨基丁酸產量與pH的影響Fig.3 Effects of ultrasonic treatment of rice bran on r-aminobutyric acid production and pH of rice bran ferment

圖4 微波預處理米糠對米糠酵素產γ-氨基丁酸產量與pH的影響Fig.4 Effect of microwave treatment of rice bran on r-aminobutyric acid production and pH of rice bran ferment

圖5 烘烤預處理米糠對米糠酵素產γ-氨基丁酸產量與pH的影響Fig.5 Effect of baking treatment of rice bran on r-aminobutyric acid production and pH of rice bran ferment

2.4.3 焙烤預處理條件對米糠酵素的影響 由圖5可知，隨著焙烤溫度的升高，GABA產量呈先升高后降低趨勢，pH呈先降低后升高的趨勢。當焙烤溫度達到210 ℃時，GABA產量為最大值0.91 g/L，pH為3.37（圖5a）。隨著焙烤時間的延長，GABA產量同樣呈先升高后降低的趨勢，pH呈先降低后升高再略有降低的趨勢。當處理米糠的焙烤時間為15 min時，GABA產量達到最大值0.91 g/L，pH為3.32（圖5b）。因此，焙烤米糠的溫度為210 ℃，焙烤時間為15 min，但經焙烤米糠發酵的米糠酵素GABA含量（0.91 g/L）小于未經處理的米糠制得米糠酵素中GABA含量（1.41 g/L），分析其原因可能為焙烤使米糠中蛋白質在高溫加熱時，引起蛋白質化學結構發生改變，氨基酸被氧化，氧化后的氨基酸鍵可以阻止酶的水解反應，從而影響了米糠酵素中pH及GABA產量。

表6 不同條件處理米糠對米糠酵素各指標的影響Table 6 Effects of different conditions on rice bran treatment on various indexes of rice bran ferment

2.5 不同預處理方式對米糠酵素品質的影響

將米糠分別在超聲（240 W、20 min）、微波(600 W、60 s)及焙烤（210 ℃、15 min）條件下預處理后，進行發酵制備米糠酵素，米糠酵素中GABA、谷胱甘肽含量、蛋白酶活力、pH、乳酸菌及酵母菌菌落數等各指標檢測結果如表6所示。

由表6可知，預處理米糠對米糠酵素各指標的大小有影響。超聲處理米糠組的GABA含量及乳酸菌菌落數均為最高，且pH最低，分別為2.61 g/L、3.17 × 108CFU/mL和3.18。未處理米糠組的發酵液中蛋白酶活力高于其他各組，但與超聲處理米糠組的差異不顯著（P＞0.05）。焙烤處理米糠組的發酵液中谷胱甘肽含量最高為126.28 μmol/L，但其它指標數據顯著低于超聲處理組（P＜0.05），因此三種預處理方式中，最優處理方式為超聲處理。

3 結論

以米糠為原料，以乳酸菌和酵母菌為發酵菌株，通過單因素及正交試驗確定制備米糠酵素的最優發酵工藝條件為：發酵溫度30 ℃，發酵時間24 h，乳酸菌與酵母菌接種比例為1:2。經超聲（240 W、20 min）、微波（600 W、60 s）及焙烤（210 ℃、15 min）預處理米糠制備米糠酵素中GABA、谷胱甘肽含量、蛋白酶活力、pH、乳酸菌及酵母菌菌落數等各指標之間存在差異，其中經超聲（240 W、24 h）預處理制備米糠酵素的GABA含量顯著高于其他組（P＜0.05）。本文通過三種預處理方式制備米糠酵素，發現制得的米糠酵素各指標之間存在差異，希望為后續米糠酵素的制備提供一種新思路。