鹿茸乙醇提取物對秀麗隱桿線蟲抗衰老的作用

劉春紅，湯燚聰，高瑜培，李云飛，陳曉光

（長春工業大學人文信息學院制藥工程學院，吉林長春 130122）

衰老是生理功能持續退化的過程，有關衰老的學說有免疫學說、遺傳基因學說、端粒學說和自由基學說等。自由基學說認為隨著年齡的增長和外界環境的有害刺激，會使機體代謝過程中產生大量自由基，并加速組織功能損傷或衰老[1-2]，大量抗衰老物質的研究是從抗氧化為入口進行探索，而衰老及與其相關的疾病已對人類健康和生命造成巨大威脅，成為當今醫學界和社會界的重要問題。因此，機體抗氧化作用能保持自由基產生與消除的平衡，對預防衰老有重要意義。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C.elegans）具有生命周期短、易培養、與人類基因相似度高等特點[3-4]，其可作為抗衰老、抗氧化研究的生物模型[5-6]，并廣泛用于藥物研究及評價。已有研究表明，胰島素/胰島素樣生長因子-1（Insulin/IGF-1）信號通路、飲食限制信號通路、線粒體信號通路在線蟲衰老調控中起重要作用[7-12]。紫薯提取物通過在胰島素信號通路中調控相關抗氧化基因的表達水平，增強抗氧化應激能力，延長線蟲壽命[13]。紫果苷提取物通過daf-16介導的途徑延長線蟲壽命[14]。枸杞通過調控線粒體內抗氧化基因的表達延長線蟲壽命[15]。

鹿茸的來源為鹿科動物梅花鹿、馬鹿等雄鹿密生茸毛尚未骨化的幼角。其性味甘、咸，歸腎、肝經，用于腎陽不足、精血虛虧、陽痿早泄、宮寒不孕、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、四肢冷、潰瘍久不愈合等[16]。鹿茸中含有豐富的蛋白質、多糖、磷脂等多種活性物質，胡太超等[17]通過測定鹿茸多肽對小鼠超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等指標的影響，證明了鹿茸多肽能降低MDA水平，提高SOD、GSHPx活性，加速自由基清除，增強小鼠抗氧化能力，達到延緩衰老和抗疲勞的作用。韓叢成等[18]通過研究復方鹿茸口服液對老年小鼠B型單胺氧化酶（monoamine oxidase B，MAO-B）、SOD、MDA、腦單胺類遞質的影響，證明了復方鹿茸口服液具有清除體內過多的活性氧自由基的作用，從而達到延緩衰老的效果。另外，鹿茸還具有提高免疫抗腫瘤、胃粘膜保護等作用[19-21]，有廣泛的藥用價值。

以往研究鹿茸抗衰老作用常以小鼠為動物模型，本文選取鹿茸乙醇提取物（velvet antler ethanol extract，VAEE）為材料，以秀麗隱桿線蟲為模型，研究其對線蟲衰老的影響，為鹿茸的深度開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌（Escherichia coli）OP50、野生型N2（Bristol）秀麗隱桿線蟲（C.elegans）、突變體線蟲clk-1（qm30）、daf-2（e1368）、eat-2（ad1116）Caenorhabditis Genetics Center（CGC）；鮮鹿茸 吉林省長春市雙陽鹿場；胰蛋白胨、瓊脂粉、NaCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、酵母提取物、膽固醇 上海薩恩科技有限公司；胡桃醌 上海阿拉丁試劑公司；SYBRGreen BIO-RAD公司。

RE-5型旋轉蒸發器 上海雅榮公司；KQ-50B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FA2004N型電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；LRH-70F生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；T6新世紀紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；SMZ-161顯微鏡 麥克奧迪公司；THZ-103B型恒溫培養搖床 上海一恒科學儀器有限公司；YM50立式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹿茸乙醇提取物的制備 將鮮鹿茸切片為厚度0.2 cm，質量30.8 g，加5倍量的50%乙醇，88 ℃回流提取4次，每次4 h。合并濾液，旋轉濃縮至流浸膏，將其加入5倍量的80%乙醇，醇沉后合并濾液并濃縮至每1.95 g濃縮液含1 g原藥材，濃縮液冷藏保存。

1.2.2 秀麗隱桿線蟲的培養及同期化 固體培養基（nematode growth media，NGM）配制：稱4.0 g瓊脂、0.5 g蛋白胨、0.6 g NaCl加入100 mL蒸餾水溶解搖勻，再加入1 mol/L MgSO4溶液、1 mol/L CaCl2溶液各200 μL，pH6.0磷酸氫鉀緩沖液3.25 mL，搖勻后補足蒸餾水至200 mL。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，溫度降至60 ℃左右，加入200 μL 5 mg/mL膽固醇乙醇溶液，倒板備用。取L4期野生型N2線蟲于涂布OP50的NGM培養基內，觀察其產卵情況，開始產卵4 h后，將L4期成蟲挑去，將卵培養至L4期成蟲，該批成蟲即為同期化成蟲。

1.2.3 加藥組與對照組NGM的配制 加藥組NGM配制方法同1.2.2，加入VAEE后，分別配制成N2VAEE 5 mg/mL、N2 VAEE 2.5 mg/mL、N2 VAEE 1 mg/mL的NGM培養基，對照組NGM的配制方法同1.2.2，加入與VAEE等量的蒸餾水，配制成相應各濃度的對照組NGM培養基。

1.2.4 對秀麗隱桿線蟲衰老指標的檢測

1.2.4.1 壽命實驗 將同期化的野生型N2線蟲，隨機挑取50條至各濃度加藥組（5、2.5、1 mg/mL VAEE）與對照組，此時記為第0 d，20 ℃下培養，每天同一時間將線蟲轉移至新的同濃度培養皿內，并觀察線蟲的存活情況。線蟲死亡及剔除標準：無運動跡象，用鉑絲輕觸后10 s無反應；線蟲因爬出培養皿失蹤或致死、蟲卵在體內孵化成袋樣蟲的不計入數據。實驗重復3次，整理數據并繪制曲線。

1.2.4.2 紫外應激實驗 將同期化的野生型N2線蟲隨機挑取30條至各濃度加藥組（5、2.5、1 mg/mL VAEE）與對照組，20 ℃下培養3 d，第4 d于紫外條件下照射1 h，再轉入相應NGM中繼續培養，此時記為第0 d，每天更換培養基同時觀察并記錄線蟲死亡情況，標準同上。實驗重復3次，整理數據并繪制曲線。

1.2.4.3 熱應激實驗 將同期化的野生型N2線蟲隨機挑取30條至各濃度加藥組（5、2.5、1 mg/mL VAEE）與對照組，20 ℃下培養3 d，第4 d于37 ℃下培養2 h，再轉入相應NGM中繼續培養，此時記為第0 d，每天更換培養基同時觀察并記錄線蟲死亡情況，標準同上。實驗重復3次，整理數據并繪制曲線。

1.2.4.4 運動實驗 將同期化的野生型N2線蟲隨機挑取50條至加藥組（2.5 mg/mL VAEE）與空白對照組，此時記為第0 d，分別于第3、5、7、9 d，隨機取10條線蟲置于M9中（M9配制方法：稱取0.3 g H2PO4，1.51 g Na2HPO4·12H2O，0.5 g NaCl，置于蒸餾水中定容至500 mL，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，溫度降至50～60 ℃時為宜，加入無菌1 mol/L MgSO4溶液500 μL），2 min后觀察30 s內每條線蟲的移動情況（身體擺動定義為頭或尾從一側擺向另一次側）。實驗重復3次，整理數據并作圖。

1.2.4.5 產卵實驗 將同期化的L4期野生型N2線蟲，隨機挑取1條至加藥組（2.5 mg/mL VAEE）與空白對照組，每組10個培養皿，此時記為產卵第1 d，每隔24 h將線蟲挑至新培養基中，每天記錄蟲卵數目（產卵量），實驗重復3次，整理數據并作圖。

1.2.5 野生型N2線蟲及突變體線蟲氧化應激實驗在20 ℃下將同期化線蟲{野生型N2線蟲、突變體線蟲eat-2（ad1116）、daf-2（e1368）、clk-1（qm30）}于加藥組、對照組NGM培養基內培養3 d后，轉入200 μmol/L胡桃醌NGM培養基中，NGM配制方法同1.2.2，待溫度降至60 ℃左右加入胡桃醌溶液，不斷攪拌，倒入培養皿中，形成終濃度為200 μmol/L的胡桃醌NGM培養基，全程盡量減少光照直射。每板50條，于顯微鏡下連續觀察線蟲每小時的死亡情況，直至線蟲全部死亡，死亡和剔除標準同上。實驗獨立重復3次，整理數據并繪制生存曲線。

1.2.6 q-PCR實驗 按照文獻報道的方法[22-23]，取30條野生型N2線蟲的成蟲產卵4 h，得到同期化的蟲卵，然后將蟲卵轉移到加藥組（2.5 mg/mL VAEE）和對照組線蟲的培養基上，線蟲成長到成蟲時期收集線蟲，按照試劑盒說明書的方法測定基因gst-4、gst-7、skn-1、hsp16.2的轉錄水平。

1.3 數據處理

數據分析采用GraphPad Prism 8.0作圖，實驗結果采用“平均值±標準差”表示，利用兩步差異分析法（ANOVA）作顯著性差異分析，“*”表示P＜0.05，差異具有統計學意義，“**”表示P＜0.01，存在顯著性差異；“***”表示P＜0.001，存在極顯著差異；“****”表示P＜0.0001,存在極極顯著差異。實驗均獨立重復3次。

2 結果與分析

2.1 鹿茸乙醇提取物對秀麗隱桿線蟲壽命及衰老生理指標的影響

2.1.1 鹿茸乙醇提取物對線蟲壽命的影響 壽命是反映衰老的一個直觀指標，本實驗檢測了鹿茸乙醇提取物對野生型N2線蟲壽命的影響。由圖1可以看出，各濃度加藥組與對照組相比壽命曲線均右移，說明VAEE對線蟲的壽命有明顯的延長作用，在第13 d現象較明顯，各濃度加藥組線蟲的活躍程度明顯強于對照組，最長壽命為28 d，從表1的平均壽命數值可以看出，與對照組相比，2.5 mg/mL加藥組效果最佳，平均壽命為19.59 d，壽命值延長了約18.2%，表明VAEE能延緩線蟲衰老。

圖1 鹿茸乙醇提取物對線蟲壽命的影響Fig.1 Effect of ethanol extract of velvet antler on life span of nematode

表1 鹿茸乙醇提取物對線蟲平均壽命的影響Table 1 Effect of ethanol extract of velvet antler on the average life of nematode

表2 紫外應激、熱應激下鹿茸乙醇提取物對線蟲平均壽命的影響Table 2 Effects of ethanol extract of velvet antler under ultraviolet and heat stress on the average life span of nematode

2.1.2 鹿茸乙醇提取物對線蟲紫外應激和熱應激的影響 抗紫外輻射和耐熱的能力也是考察抗衰老的一種表現。有研究表明，過度的紫外輻射會引起機體DNA損傷，誘導細胞凋亡[24]。李貞景等[25]發現花生四烯酸對紫外輻射損傷后的線蟲具有一定的修復作用，能降低線蟲體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平。本實驗檢測了鹿茸乙醇提取物對野生型N2線蟲紫外應激和熱應激的影響。由表2和圖2A可知，線蟲在紫外輻射條件下，1 mg/mL加藥組與對照組相比不能延長線蟲生存時間，2.5 mg/mL加藥組線蟲平均壽命為2.81 d，2.5 mg/mL與5 mg/mL加藥組與對照組相比，曲線明顯右移，具有極極顯著性差異（P＜0.0001），能增強線蟲抗紫外應激的能力。由表2和圖2B可知，線蟲在高溫條件下，各濃度的加藥組與對照組相比，線蟲平均壽命均顯著延長，2.5 mg/mL加藥組線蟲平均壽命為3.28 d，曲線明顯右移，能增強線蟲抗熱應激的能力，這與q-PCR實驗結果中，VAEE能上調熱抗性基因hsp16.2的轉錄水平相一致。

圖2 鹿茸乙醇提取物對線蟲紫外應激和熱應激的影響Fig.2 Effects of ethanol extract of velvet antler on ultraviolet and heat stress of nematode

2.1.3 鹿茸乙醇提取物對線蟲運動能力和生殖能力的影響 線蟲運動能力和產卵量這兩個指標同線蟲的壽命具有直接相關性，能評價線蟲的衰老速度。在壽命和紫外應激實驗中2.5 mg/mL鹿茸乙醇提取物作用效果最佳，因此選用此濃度檢測線蟲運動能力和產卵量。線蟲的運動能力不但能夠體現機體健康情況，還能反映神經系統的健康程度。從擺動實驗結果（圖3）可以看出，與對照組相比，從第5 d開始鹿茸乙醇提取物能顯著提高線蟲的運動能力（P＜0.01）（圖3A）；從產卵實驗結果可以發現，與對照組相比，鹿茸乙醇提取物從第3 d開始能極極顯著提高線蟲的產卵量（P＜0.0001）（圖3B），表明其對線蟲的生殖能力有正向增強作用，達到延緩衰老的作用。

2.2 鹿茸乙醇提取物對秀麗隱桿線蟲氧化應激的影響

外界環境刺激以及線粒體會產生各種過氧化因子，如超氧陰離子、H2O2、羥自由基等，它們可以觸發細胞內氧化反應，同時細胞進化了抗氧化防御系統，如SOD、GSH-Px、Vc、VE等[26-27]，來應對過量的活性氧。趙玉紅等[28]發現鹿茸單一多糖對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基均有清除作用，具有抗氧化活性；陳曉光等[29]發現鹿茸多胺能明顯提高小鼠清除自由基的能力，抑制脂質過氧化反應，具有抗氧化作用；Ding等[30]從鹿茸中提取純化得到抗氧化四肽，它能夠抑制肝細胞活性氧的產生，在體外及斑馬魚模型中表現出明顯的抗氧化能力。

胡桃醌能使暴露在其中的線蟲體內活性氧增多，影響機體正常生理代謝，造成組織損傷導致線蟲死亡[31]。本實驗構建了200 μmol/L胡桃醌氧化應激條件，考察了鹿茸乙醇提取物對野生型N2線蟲在此條件下的生存時間。實驗表明，各濃度加藥組線蟲的平均壽命均延長，且生存曲線較對照組都明顯右移（表3，圖4A），表明鹿茸乙醇提取物具有明顯的抗氧化應激能力，這可能與其含有多種能降低各種過氧化因子的活性物質有關。其中2.5 mg/mL與5 mg/mL加藥組效果接近，但在壽命實驗中2.5 mg/mL加藥組效果最佳，因此選用該濃度應用于突變體線蟲。

圖3 鹿茸乙醇提取物對線蟲運動能力和生殖能力的影響Fig.3 Effects of ethanol extract of velvet antler on locomotor and reproductive ability of nematode

為進一步探究鹿茸乙醇提取物抗衰老作用機理，考察了3條相關信號通路的突變體線蟲在氧化應激條件下的生存時間。實驗結果表明，在胰島素信號通路突變體線蟲daf-2和飲食信號通路突變體線蟲eat-2的氧化應激實驗中，加藥組與對照組相比線蟲平均壽命延長，生存曲線明顯右移（表3，圖4B和4C），鹿茸乙醇提取物能增強daf-2、eat-2突變體線蟲的抗氧化應激能力，然而clk-1突變體線蟲加藥組與對照組的平均壽命和生存曲線無明顯差異（P=0.8597），表明鹿茸乙醇提取物抗氧化作用可能與線粒體信號通路有關（表3，圖4D）。

表3 鹿茸乙醇提取物對線蟲在氧化應激下平均壽命的影響Table 3 Effects of ethanol extract of velvet antler on the average life spans of C.elegans under oxidative stress

2.3 鹿茸乙醇提取物對抗氧化基因轉錄水平的影響

q-PCR實驗結果表明，濃度為2.5 mg/mL的鹿茸乙醇提取物能夠上調經典的抗氧化基因gst-4、gst-7和skn-1及熱抗性基因hsp16.2的轉錄水平，且差異具意義（P＜0.05）（圖5）。

3 結論

通過在鹿茸乙醇提取物對線蟲衰老影響的相關實驗中，發現鹿茸乙醇提取物為2.5 mg/mL時具有最佳的抗衰老作用。線蟲壽命實驗研究顯示，VAEE為2.5 mg/mL時線蟲平均壽命為19.59 d，最長壽命為28 d，強于對照組；線蟲紫外應激和熱應激實驗研究顯示，VAEE為2.5 mg/mL時線蟲平均壽命分別為2.81 d和3.28 d，與對照組比具有極極顯著性差異（P＜0.0001）；VAEE在該濃度下與對照組比，從第5 d開始能顯著提高線蟲的運動能力，從第3 d開始極極能顯著（P＜0.0001）提高線蟲的產卵量；野生型N2線蟲氧化應激實驗研究顯示，VAEE為2.5 mg/mL時線蟲平均壽命為4.58 h，優于對照組；加藥組與對照組clk-1突變體線蟲在氧化應激實驗中生存時間無明顯差異，VAEE能夠通過clk-1信號通路促進SKN-1細胞核轉位降低內源性ROS，進而上調抗氧化基因gst-4、gst-7和skn-1及熱抗性基因hsp16.2在線蟲體內的表達。

綜上所述，鹿茸乙醇提取物具有抗衰老及抗氧化作用，本文為鹿茸的后續開發利用提供參考。

圖4 鹿茸乙醇提取物對線蟲氧化應激的影響Fig.4 Effect of ethanol extract of velvet antler on oxidative stress of nematode

圖5 鹿茸乙醇提取物對線蟲基因轉錄水平的影響Fig.5 Effects of ethanol extract of velvet antler on gene transcription level of nematode