一種基于蚯蚓學習行為的神經毒性實驗方法研究

陳修才，周世萍，李惠娟，解思達，熊張平，楊廣斌，朱鑫澤

西南地區林業生物質資源高效利用國家林業與草原局重點實驗室(西南林業大學)，昆明 650224

農業土壤環境質量狀況的正確診斷和評價，是土壤污染管控修復，逐步改善土壤環境質量，保持土壤生態系統良性循環的重要管理依據。由于土壤性質和污染物種類的復雜多變，對土壤環境健康質量的診斷和評價，必須同時考慮土壤微生物、土壤動物和植物的異常變化。蚯蚓作為土壤動物區系的代表類群，利用蚯蚓生物標志物評價污染物對土壤環境的危害，從而對土壤健康質量進行診斷和評價已成為環境研究領域較受關注的研究熱點之一[1-5]。

由于有機磷和擬除蟲菊酯類多數農藥污染物均具有神經毒性，污染土壤的神經毒性可直接影響蚯蚓等土壤動物的神經行為狀況，這種神經行為變化也可以反映土壤的健康質量狀況。與乙酰膽堿酯酶這類神經毒性生理生化標志物相比，神經行為標志物的優點在于研究過程中可以對同一受試動物反復進行測試，同時研究可以涵蓋神經損傷的開始、發展及恢復整個過程[6]。學習行為是動物通過實踐獲得新信息從而改變之后的行為模式，是一種綜合性的神經高級活動。動物的學習行為受神經系統支配，是一項比較敏感的行為指標，通過測試學習行為的功能變化，能夠有效評價污染物對土壤動物的神經毒性及潛在危害，對土壤健康質量診斷評價具有重要的研究意義和應用價值。

在動物界所有的類群中，從單細胞動物到脊椎動物都存在學習過程。雖然蚯蚓的腦容量較小，但研究表明蚯蚓具備一定的學習能力。Yerkes[7]首次通過實驗證實了蚯蚓(Allolobophorafoetida)的學習行為，隨后的研究也表明，陸正蚓(Lumbricusterrestris)和赤子愛勝蚯蚓(Eiseniafoetida)等不同種屬的蚯蚓均具備一定的學習能力[8-12]。目前常用的蚯蚓學習行為測試方法是迷宮實驗，但該方法需要對蚯蚓進行大量訓練，耗時較長，且訓練和測試過程容易受蚯蚓分泌物的信息誘導，影響測試結果的準確性[12]，難以滿足對土壤健康質量進行快速有效診斷的要求。有研究表明，蚯蚓對紅光不敏感，厭惡白光，可以通過振動與白光的配對刺激誘導蚯蚓的學習行為[13]，但如何利用蚯蚓的學習行為，對污染土壤的健康質量進行快速診斷，目前尚缺乏靈敏有效的測定方法。

針對此問題，本研究設計了一套試驗裝置，以紅光作為照明光源，通過振動與白光配對刺激，對蚯蚓的學習行為進行誘導，在此基礎上，通過對測定條件進行優化，建立了蚯蚓學習行為的測定方法，希望該方法能夠應用于土壤神經毒性污染物的快速診斷，為農業土壤環境健康質量的診斷評價提供可行的測定方法。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗裝置

實驗裝置為自制的學習行為測試裝置(圖1)。測試盒容積為45 cm×45 cm×25 cm。為便于觀察和透氣，測試盒為單面敞開的半封閉式結構，測試臺位于測試盒底部，為模擬蚯蚓在土壤中的移動環境，測試臺鋪設有圓形凸起(凸起高度為0.5 cm；相鄰凸起點的距離為3 cm)的塑膠墊，塑膠墊面積為40 cm×40 cm；測試臺底部設有振動馬達，振動頻率為180 Hz；測試臺上方安裝功率均為3 W的紅色燈和白熾燈各1個，及可以定時控制的噴霧裝置(噴霧量20 mL·h-1)。其中，白熾燈安裝于箱體頂部的中心位置，距白熾燈安裝位置左右各1 cm處，分別安裝紅色燈和噴霧裝置。安裝后的紅色燈和白色燈距測試臺20 cm，測試時將蚯蚓放置于測試臺的中心位置，紅色燈作為測試的照明光源，白熾燈提供測試所需的白光刺激。

圖1 蚯蚓學習行為的測試裝置示意圖

1.2 實驗材料

供試生物為云南紅河地區采集的皮質遠盲蚓(Amynthascorticis)，培養條件為：溫度20 ℃；土壤含水量為田間最大持水量60%。挑選2～3月齡，體質量0.4～0.5 g，具有成熟環帶的健康蚯蚓作為實驗蚯蚓。

供試試劑：東莨菪堿(純度>98%)與毒死蜱(純度>98%)購自美國Sigma公司。

供試土壤：土壤采自昆明市官渡區農田2～15 cm耕作層。在采樣地設5個采樣點，取樣后充分混合，得到實驗用土樣。土樣風干后過1 mm篩備用。土壤類型為紅壤，質地為粘壤土，pH為6.35，有機質含量為14.75 g·kg-1，陽離子交換量為9.8 cmol·kg-1，土壤經分析未檢出毒死蜱和東莨菪堿。

1.3 蚯蚓學習行為測定方法建立

蚯蚓學習行為測定在暗室中進行。該方法是基于蚯蚓對白光刺激的厭惡本性，采用自制的測試裝置，通過振動-白光配對刺激訓練，使蚯蚓學習領會借助加速運動阻止白光刺激的策略。為實現上述目的，需要進行下列測試條件優化。

1.3.1 移動位移閾值確定

移動位移閾值是蚯蚓學習行為測定的關鍵。為了獲得蚯蚓移動位移閾值的最佳參數，在多次預實驗的基礎上，篩選出可能的蚯蚓移動位移閾值6、8、9、10和12 cm，將其設定為測試條件，對其進行測試。設置4個測試組，每組10條蚯蚓，每次測試時，將1條蚯蚓放置于測試臺，開啟紅色照明燈，適應10 min后對其分別進行振動、白光刺激各30 s，測定蚯蚓頭部運動距離達到移動位移設定值的次數，根據測定數據計算蚯蚓頭部運動距離達到移動位移閾值的到達率(A)，計算公式為：

式中：B為30 s振動或光照刺激時蚯蚓頭部運動距離達到各移動位移設定值的次數；C為30 s振動或光照刺激時蚯蚓頭部運動距離達到各移動位移設定值的次數總和。

1.3.2 蚯蚓學習行為測定條件優化

對蚯蚓的學習行為測定是通過30 s振動與30 s白光配對刺激進行，在多次預實驗的基礎上，發現影響蚯蚓學習行為測定的條件主要有休息恢復時間和學習周期，需要對這2個條件進行優化。

(1)休息恢復時間

根據預實驗篩選出可能的休息恢復時間為6、7、8、9和10 min，將其分別設定為休息恢復條件，每個條件設4個重復組，每組10條蚯蚓，對其進行條件優化。測試時，將1條蚯蚓放置于測試臺，開啟紅色照明燈，適應10 min后對其進行包括30 s振動/30 s白光/30 s振動/30 s白光/30 s振動/30 s白光的1個周期學習測試。測試期間對蚯蚓的移動進行監控，如振動刺激期間，蚯蚓頭部運動距離達到或超過移動位移閾值，則隨后的白光刺激不出現，但振動刺激仍然持續；如白光刺激期間，蚯蚓頭部運動移動達到或超過移動位移閾值，則立即關閉照明燈，停止白光刺激，待下一個振動刺激開始時繼續進行循環刺激學習。分別測定每次振動和白光刺激時，蚯蚓頭部運動距離達到或超過移動位移閾值的所需時間；學習結束后按照設置的休息條件進行恢復，再對蚯蚓進行學習測試(測試條件同上)。

(2)學習周期

每個學習周期包括30 s振動/30 s白光/30 s振動/30 s白光/30 s振動/30 s白光，在預實驗的基礎上，篩選出1、2、3和4個學習周期作為學習條件，每個條件設4個重復組，每組10條蚯蚓。每個學習周期結束后，應按照(1)優化的休息恢復時間，讓蚯蚓進行休息恢復后再進行下一周期的學習。休息期內關閉振動及白光，打開噴霧器進行噴霧待休息結束關閉。分別測定各訓練周期內蚯蚓每次振動和光照刺激期間，頭部運動距離達到或超過移動位移閾值的所需時間，根據測定數據，對學習周期進行優化。

1.3.3 蚯蚓的學習行為測定

東莨菪堿是動物學習障礙模型造模的代表藥物[13]，因此，利用東莨菪堿和具有神經毒性的毒死蜱農藥[14]對測定方法進行了驗證。在蚯蚓未表現出回避反應的濃度范圍內分別設置3個濃度梯度：東莨菪堿處理組(1、2和3 mg·kg-1)、毒死蜱處理組(4、8和12 mg·kg-1)，按照實驗土壤設計濃度計算東莨菪堿需要量，準確稱量后將所需試劑用丙酮溶解后，攪拌混勻于20 g土壤中，待丙酮完全揮發后(無丙酮氣味)再與480 g土壤混勻，放入500 mL培養瓶內，加入蒸餾水將土壤含水量調節為土壤田間最大持水量的60%。將清腸處理后的蚯蚓隨機放入東莨菪堿處理和毒死蜱各濃度處理組中，每組放入10條蚯蚓，以保鮮膜封口(預留換氣孔)。在溫度為24 ℃、濕度為60%條件下培養，以丙酮空白為對照組，每個濃度及對照設4個重復。染毒處理1 d后取出蚯蚓，采用本研究的測試裝置及建立的蚯蚓學習行為測定方法，對蚯蚓的學習行為進行測定。

1.4 數據統計與分析

采用SSPS 13.0軟件(SPSS Inc.)進行單因素方差分析和多重比較，對組間數據進行差異顯著性分析，數據結果用mean±SD的形式表示。

2 結果(Results)

2.1 蚯蚓移動位移閾值確定

蚯蚓到達不同移動位移設定閾值的到達率(A)如圖2所示，振動和白光刺激條件下，A均隨著閾值設定值的增加而下降；相同設定閾值條件下，白光刺激條件下的A值均高于振動刺激的到達率，當設定閾值為9 cm時，白光刺激條件下蚯蚓的A值顯著高于振動刺激條件下的A值(P<0.05)，而其他設定閾值條件下，白光刺激時蚯蚓A值與振動刺激的A值均不存在顯著差異(P>0.05)，但設定閾值達到或超過10 cm時，蚯蚓在振動和白光刺激條件下的A值均呈現顯著下降，原因可能與此閾值設定過高，振動或白光刺激時蚯蚓移動均難以達到有關。本研究選擇移動位移設定值9 cm作為移動位移閾值。

圖2 不同移動設定閾值對蚯蚓到達率(A)的影響

2.2 休息恢復時間對蚯蚓學習行為的影響

不同休息恢復時間對蚯蚓的學習影響如圖3所示，恢復時間為5～6 min，休息恢復后蚯蚓學習測試的到達移動位移閾值時間，顯著高于恢復前學習測試的到達位移閾值時間(P<0.05)；恢復時間為7～9 min，休息恢復后蚯蚓學習測試的到達位移閾值時間，與恢復前蚯蚓學習測試的到達位移閾值時間并無顯著差異(P﹥0.05)，表明蚯蚓經過7～9 min的休息后，體力已基本恢復，本研究選擇7 min作為蚯蚓的休息恢復時間。

圖3 不同休息恢復時間對蚯蚓學習行為的影響

2.3 學習周期對蚯蚓學習行為的影響

不同學習訓練周期對蚯蚓學習行為的影響如圖4所示。隨著學習訓練周期增加，蚯蚓的移動速度加快，到達移動位移閾值的時間不斷縮短，當學習訓練達到3個周期時，蚯蚓到達移動位移閾值的時間已顯著低于訓練1～2個周期的到達移動位移閾值時間(P<0.05)，但學習訓練3個周期后，蚯蚓到達移動位移閾值的時間已基本穩定，與學習訓練4個周期的蚯蚓到達移動位移閾值時間無顯著差異(P﹥0.05)，本研究選擇3個訓練周期作為蚯蚓的學習訓練條件。

圖4 不同學習周期對蚯蚓學習行為的影響

2.4 蚯蚓的學習行為測定

采用本研究建立的蚯蚓學習行為測定方法，對東莨菪堿和毒死蜱暴露1 d后的蚯蚓學習行為進行了測定，結果如圖5所示。東莨菪堿和毒死蜱不同暴露濃度組中蚯蚓到達移動閾值的時間均顯著高于對照組，隨著東莨菪堿和毒死蜱暴露濃度的增加，蚯蚓到達移動閾值的時間顯著增加，表明東莨菪堿和毒死蜱處理均導致了蚯蚓的學習能力下降，暴露濃度越高，對蚯蚓的學習行為損傷越嚴重。

圖5 不同污染處理對蚯蚓學習行為的影響

3 討論(Discussion)

污染物的毒性可直接影響土壤動物的行為，這種行為變化對污染物的毒性具有指示作用，因此可以通過土壤動物的行為變化來監測、評價污染物的生態風險。學習行為是動物借助于個體生活經歷和經驗使自身的行為發生適應性變化的過程，是一種綜合性的神經高級活動，對土壤污染物神經毒性的生態風險監測具有重要價值，但由于缺乏蚯蚓學習行為測定的有效方法，在土壤生態毒性的監測評價中應用較少。

目前動物學習行為的測定主要采用迷宮實驗方法[15-19]，這種測定方法主要測試的是動物的空間識別學習能力。采用這種方法對蚯蚓進行學習行為測試時，由于測試過程中蚯蚓會產生分泌物，蚯蚓在空間識別學習時會受到分泌物的信息干擾，需要對測試裝置及時進行清理，否則會影響測試的準確性[12]。本研究建立的蚯蚓學習行為測試方法是基于蚯蚓厭惡白光刺激的特性，采用振動與白光配對刺激對蚯蚓進行學習測試。學習過程中當蚯蚓移動加快，移動位移達到或超過移動閾值時，就不出現或停止白光刺激，如未達到移動閾值，則出現或繼續白光刺激。通過振動、白光刺激的交替循環學習訓練，使蚯蚓領會可以借助加速運動阻止白光刺激的策略。如蚯蚓通過學習已領會此策略，則在振動和白光刺激時，蚯蚓將會加快移動來阻止白光刺激，通過對其達到移動閾值的時間測定，就可以反映蚯蚓的學習行為變化，因此對蚯蚓的學習行為測試不受蚯蚓分泌物干擾的影響。

蚯蚓移動位移閾值是蚯蚓學習行為測定能否有效的關鍵。移動位移閾值設置過低，蚯蚓在振動刺激期間就能輕易達到，會導致蚯蚓難以進入隨后的白光刺激學習；移動位移閾值設置過高，則蚯蚓在振動和白光刺激學習期間，因難以達到移動位移閾值，而不能領會可以通過加速移動阻止白光刺激的策略。移動位移閾值應是蚯蚓應激狀態下能夠達到的移動閾值，這樣蚯蚓才能通過學習，領會加速移動阻止白光刺激的策略。

本研究的結果表明，當移動位移閾值設定為6～8 cm時，不同刺激條件下蚯蚓到達不同設定值的到達率并無顯著差異(P﹥0.05)(圖2)，說明設定值過低，蚯蚓在振動刺激期間就能輕易達到；而當移動位移閾值設定為10～12 cm時，振動刺激條件下蚯蚓到達不同設定值的到達率為2.2%～22.2%(圖2)，白光刺激條件下蚯蚓到達不同設定值的到達率為5.8%～25.8%(圖2)，表明此閾值設定過高，振動或白光刺激時蚯蚓移動均難以達到設定值；當蚯蚓移動位移閾值設定為9 cm時，振動刺激時蚯蚓到達設定值的到達率顯著低于白光刺激的到達率(P<0.05)，說明9 cm的移動位移設定值是蚯蚓在應激狀態下能夠達到的移動閾值。

由于蚯蚓學習過程中的運動消耗較大，每個學習周期結束后應讓蚯蚓進行休息恢復。本研究中，休息恢復時間為5～6 min，休息后學習測試的蚯蚓到達移動位移閾值時間，顯著大于恢復前學習測試的蚯蚓到達移動位移閾值時間(P<0.05)，這可能是由于休息時間不夠，蚯蚓的運動消耗未能恢復，而導致測定時移動能力下降；休息時間為7～9 min，休息后蚯蚓學習測試的到達移動位移閾值時間，與休息前的到達時間并無顯著差異(P﹥0.05)，表明蚯蚓經過7～9 min的休息后，運動消耗已基本恢復，能夠進行下一周期的學習測試。

與迷宮實驗相比，本研究建立的蚯蚓學習行為測試裝置結構簡單，測試方案蚯蚓易于領會。當學習訓練達到3個周期時，蚯蚓到達移動位移閾值的時間已顯著低于訓練1～2個周期的到達移動位移閾值時間(P<0.05)，說明蚯蚓經過3個周期的學習訓練后已能領會到借助加速運動阻止白光刺激的策略，而采用迷宮實驗對蚯蚓進行學習行為測試，一般需要對蚯蚓進行長時間的多次重復訓練[8-12]。李力和潘雷[11]對蚯蚓(Eiseniafoetida)學習行為的迷宮實驗表明，蚯蚓需要80次以上的訓練，才能進行學習測定，迷宮設置越難，需要的訓練次數就越多。

為了驗證本研究的裝置及方法對蚯蚓學習行為的測試是否有效，筆者采用東莨菪堿和毒死蜱污染土壤對蚯蚓進行染毒處理，對染毒后的蚯蚓進行學習測試。東莨菪堿是常用的動物學習障礙模型造模藥物，可以阻斷大腦皮質、隔區及海馬結構的乙酰膽堿結合位點，導致學習障礙[13]。毒死蜱不僅具有神經毒性，而且是目前我國廣泛使用且土壤污染較為嚴重的有機磷農藥品種[20-23]，有研究表明，毒死蜱會造成動物的神經元損傷和學習障礙[24]。本研究的測試結果表明，東莨菪堿和毒死蜱污染暴露均導致了蚯蚓的學習障礙，且污染濃度越高，對蚯蚓的學習行為損傷越嚴重，應用本研究建立的測試方法，染毒1 d后即可檢測到蚯蚓學習行為的變化。與利用半致死濃度(LC50)等常用的毒理學檢測方法相比，不僅檢測靈敏度大大提高，而且短期暴露后就可以檢測，有望用于低濃度神經毒性農藥污染土壤的神經毒性快速診斷。由于本研究采用的實驗生物為皮質遠盲蚓，未對其他品種的蚯蚓學習行為進行深入研究，考慮到不同品種的蚯蚓學習行為能力可能存在差異，該方法是否適合其他蚯蚓品種對低濃度神經毒性污染物污染土壤的毒性檢測，還有待進一步研究，今后應加強此方面的研究工作。