不同污染方式進入土壤的氯氰菊酯在蚯蚓體內的蓄積特征及其生長毒性

熊張平，周世萍，解思達，郭佳葳，李惠娟，陳修才

西南地區林業生物質資源高效利用國家林業與草原局重點實驗室(西南林業大學)，昆明 650224

氯氰菊酯是擬除蟲菊酯類農藥的重要品種，也是目前我國廣泛使用且污染最為嚴重的擬除蟲菊酯類農藥品種之一[1-4]。劉航[1]對2013—2016年我國遼寧省蔬菜安全狀況進行了調查，發現蔬菜中氯氰菊酯農藥超標嚴重。近5年研究者對我國云南省昆明市晉寧區等主要蔬菜和花卉產區的農藥殘留調查發現，農田土壤中氯氰菊酯的殘留檢出率相對較高。氯氰菊酯為非極性殺蟲劑，易被土壤吸附并固定，土壤是氯氰菊酯在環境中的主要歸宿[5-7]。蚯蚓作為土壤動物區系的代表類群，利用蚯蚓作為土壤環境的指示生物，可以提供保護整個土壤動物區系的安全域值，評價污染物可能對環境的危害程度，從而對其可能導致的生態風險進行監測管理[8-12]。

一次污染是利用蚯蚓作為指示生物，研究農藥污染物可能導致的生態風險常用的污染方式。這種污染方式是在供試土壤中一次性加入污染物，使其土壤濃度達到實驗設計濃度。多次疊加污染是采用低劑量多次疊加的方式加入實驗農藥，使其土壤最終疊加濃度達到所需設計濃度。以不同污染方式進入土壤的農藥可能因降解變化，導致其生物可利用性變化，從而影響其生物毒性。與一次污染方式相比，低劑量多次疊加的方式更接近實際土壤環境中農藥低劑量多次施用逐步累積的污染過程，而目前已有的以蚯蚓作為研究生物對氯氰菊酯生態風險的研究均是基于一次污染方式[13-15]，缺乏疊加污染條件下的基礎研究，污染方式是否影響氯氰菊酯對蚯蚓的生物毒性及生態風險評價，是過去研究中尚未明確的問題。

為此，本研究選擇云南耕地常見的本地種蚯蚓——皮質遠盲蚓為研究對象，分別采用高劑量一次污染與低劑量多次疊加污染的方式，模擬氯氰菊酯進入土壤的過程，從蚯蚓對氯氰菊酯的吸收蓄積入手，研究不同污染方式條件下，蚯蚓對氯氰菊酯的生物富集變化規律以及氯氰菊酯蓄積對其生長影響，為土壤農藥疊加污染累積的生態風險評價及防治，提供基礎數據和理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

供試農藥：氯氰菊酯標準品(純度>98%)購自美國Sigma公司。

供試土壤：土壤采自昆明市西南林業大學實驗地2～15 cm耕作層。采用對角線取樣法，于5個采樣點分別采取質量相等的土樣后，充分混合得到實驗用土壤。土樣風干后過1 mm篩備用。土壤類型為紅壤，陽離子交換量為10.1 cmol·kg-1，質地為粘壤土，pH為6.55，有機質含量為17.86 g·kg-1，土壤經分析未檢出氯氰菊酯。

供試生物為云南紅河地區采集的皮質遠盲蚓，培養條件為：溫度控制20 ℃，自然光照，土壤含水量為田間最大持水量50%。實驗蚯蚓選用2～3月齡，體質量0.4～0.5 g，具有成熟環帶的健康蚯蚓。實驗前將蚯蚓在供試土壤中適應1周后取出，用純水沖洗放入鋪有濕潤滅菌紗布的玻璃皿中，恒溫(20 ℃)暗室培養24 h，進行清腸處理備用。

1.2 蚯蚓對土壤氯氰菊酯的生物富集實驗

本研究分別采用一次添加和多次疊加的污染染毒方式進行生物富集實驗。一次添加是指在供試土壤中一次性加入氯氰菊酯，使其土壤濃度達到實驗所需設計濃度；多次疊加污染則是采用低劑量多次疊加的方式加入氯氰菊酯，使其土壤最終疊加濃度達到所需設計濃度。按照氯氰菊酯10%乳油防治蚜蟲和紅鈴蟲等蟲害常用的田間單次最大施用劑量(90 g·hm-2)施用時，測得土壤氯氰菊酯原始沉積量為(1.71±0.31) mg·kg-1，考慮到實際防治中氯氰菊酯的施用次數一般為2～3次，每次間隔期為7 d。因此，疊加實驗的單次疊加劑量設置為2.0 mg·kg-1，疊加間隔時間設置為7 d，疊加次數分別設置為2次和3次。

為便于比較研究，一次添加污染的生物富集實驗中，氯氰菊酯實驗濃度與2次和3次的疊加總濃度相同，分別為4 mg·kg-1和6 mg·kg-1。根據土壤氯氰菊酯設計濃度計算氯氰菊酯需要量，以丙酮溶解后攪拌混勻于20 g土壤中，待丙酮完全揮發后再與480 g土壤混勻，放入500 mL培養瓶內，加入蒸餾水將土壤含水量調節為土壤田間最大持水量的50%。

將清腸處理后的蚯蚓隨機放入對照組和處理組，每瓶放入20條蚯蚓，以保鮮膜封口(預留換氣孔)。在濕度為50%、溫度為20 ℃的條件下培養，每隔7 d給予5 g磨碎的干牛糞作為餌料，以丙酮空白為對照組，每個濃度及對照設3個重復。

多次疊加污染的生物富集實驗，疊加總濃度與一次污染濃度相同，但需要進行分次疊加，各次疊加劑量均為2 mg·kg-1，疊加次數分別設置為2次和3次，疊加間隔時間為7 d，其余處理條件均與一次污染相同。每次疊加時，先將蚯蚓與土壤分離，將蚯蚓置于暗處濕潤濾紙上，取出實驗土壤20 g，將疊加所需的氯氰菊酯用丙酮溶解后，拌于取出的土壤中，待丙酮完全揮發后(無丙酮氣味)再與其剩余土壤混勻后，再將蚯蚓放入各實驗土壤。疊加全部完成后土壤氯氰菊酯疊加總濃度分別為4 mg·kg-1和6 mg·kg-1，與一次添加污染方式處理的氯氰菊酯實驗濃度相同。

1.3 樣品測定

在21 d疊加污染實驗完成后采樣，分別于生物富集實驗第21、28、35、45和55天，對處理組和對照組進行取樣，各平行組采取2條蚯蚓和10.0 g土壤，將蚯蚓用去離子水洗凈、清腸、準確稱重，分別測定土壤樣品中氯氰菊酯的殘留量、蚯蚓體內氯氰菊酯蓄積量和蚯蚓脂肪質量分數(%) (flipid)。根據測定數據計算生物-土壤蓄積因子(FBSA)，計算公式為：

(1)

式中：cew為蚯蚓體內氯氰菊酯含量(mg·kg-1)；cs為土壤中氯氰菊酯含量(mg·kg-1)；flipid為蚯蚓脂肪質量分數(%)；foc為土壤有機質含量(g·kg-1)

脂肪含量測定參照文獻[16]。將蚯蚓清腸24 h后準確稱量體質量(mo)，放入預先稱量質量(m1)的離心管中，加入10 mL的甲醇-氯仿溶劑(1∶1，V/V)勻漿后超聲處理5 min，平衡4 h后離心10 min(8 000 r·min-1)，收集上清液于50 ℃干燥后準確稱量(m2)。根據測定數據計算蚯蚓脂肪含量，計算公式為：

(2)

蚯蚓氯氰菊酯蓄積量測定方法如下。將蚯蚓用去離子水洗凈、清腸，準確稱重后置于10 mL聚丙烯離心管中，加入石油醚1 mL，采用電動玻璃勻漿機勻漿3 min后以4 000 r·min-1離心10 min，將上清液轉入另一離心管中，再加入5 mL石油醚繼續離心10 min，合并2次上清液為提取液。在凈化柱底端裝入處理脫脂棉，依次加入5.0 g無水硫酸鈉，3.0 g弗羅里硅土，5.0 g無水硫酸鈉，用2 mL石油醚預淋洗后加入提取液過柱，分別用10 mL洗脫液淋洗2次后收集淋洗液，在旋轉蒸發儀(30 ℃水浴)濃縮近干。用石油醚充分溶解并定容至1 mL，進行氣相色譜(GC)測定。檢測條件：色譜柱為DM-1石英毛細管柱(30 m×0.25 m×0.25 μm)；檢測器溫度為320 ℃；進樣口溫度為280 ℃；柱溫度的升溫程序為200 ℃(0.75 min)，285 ℃(10 min)；氮氣流速為40 mL·min-1。

土壤中氯氰菊酯殘留量測定方法如下。將所取土壤置于三角瓶中，加入40 mL丙酮-石油醚(1∶1，V/V)提取液于30 ℃水浴恒溫振蕩2 h后過濾，用5 mL提取液洗滌濾渣3次，合并濾液于分液漏斗中，加入12% NaCl 20 mL，用20 mL石油醚萃取3次后，收集并合并石油醚相經無水硫酸鈉除水后在旋轉蒸發儀上(30 ℃水浴)減壓濃縮近干。用1 mL石油醚定容，進行GC測定，測定條件同上。對測定數據擬合得出氯氰菊酯在土壤中的降解方程：

ct=c0×e-kt

(3)

式中：c0為氯氰菊酯初始濃度(mg·kg-1)；ct為時間t時土壤中氯氰菊酯殘留量(mg·kg-1)；t為降解時間(d)；k為降解常數；e為自然常數。

1.4 質量控制與數據分析

在樣品分析過程中采用方法空白、平行樣(每個試驗組設置3個平行)以及加標回收率測定進行質量控制。在土壤和蚯蚓樣品中分別添加氯氰菊酯標樣，采用1.2部分測定方法測定回收率。土壤樣品的加標回收率為91.5%～105.2%，蚯蚓樣品的加標回收率為90.1%～106.2%。所有統計均采用SPSS22.0和Origin Pro8.0軟件完成。應用單變量多因素方差分析確定暴露濃度、暴露時間和染毒方式及其共同作用對蚯蚓生物富集和生長影響；不同濃度處理組之間采用單因素ANOVA進行多重比較分析(LSD)。

2 結果(Results)

2.1 不同污染方式進入土壤的氯氰菊酯殘留動態

對以一次添加和多次疊加污染方式進入土壤的氯氰菊酯殘留量的測定數據進行擬合，得到的模型參數如表1所示。由表1可知，不同污染方式進入土壤的氯氰菊酯在土壤中的降解動態均符合一級動力學模型，一次污染條件下，氯氰菊酯在土壤中的降解半衰期分別為27.7 d(4 mg·kg-1)和28.9 d(6 mg·kg-1)；疊加污染條件下，氯氰菊酯在土壤中的降解半衰期分別為25.7 d(4 mg·kg-1，2次疊加)、26.6 d(6 mg·kg-1，3次疊加)。相同實驗濃度條件下，與疊加污染方式相比，以一次污染方式進入土壤的氯氰菊酯在土壤中的降解相對緩慢。

表1 不同污染方式進入土壤的氯氰菊酯降解參數

2.2 蚯蚓對不同污染方式進入土壤的氯氰菊酯蓄積

空白對照組的蚯蚓體內均未檢出氯氰菊酯，蚯蚓對不同方式進入土壤的氯氰菊酯吸收蓄積量變化如圖1所示，暴露21 d時，蚯蚓對以一次污染方式進入土壤的不同濃度氯氰菊酯蓄積量均達到最大，不同濃度處理組蚯蚓體內氯氰菊酯的蓄積量差異顯著(P<0.05)；隨著暴露時間延長，蚯蚓體內氯氰菊酯蓄積量持續下降，暴露35～55 d，各濃度處理組蚯蚓的氯氰菊酯蓄積量已基本穩定，同一濃度處理組蚯蚓暴露35 d和55 d后，體內氯氰菊酯蓄積量并無顯著差異性(P>0.05)。

如圖1所示，蚯蚓對疊加污染方式進入土壤的氯氰菊酯蓄積量與疊加次數、暴露時間相關。實驗暴露期間，不同疊加次數處理組中，蚯蚓體內的氯氰菊酯蓄積量均隨暴露時間增加而緩慢上升，但相同疊加次數處理組中，不同暴露時間的蚯蚓氯氰菊酯蓄積量差異不顯著(P>0.05)。隨著疊加次數增加，蚯蚓體內的氯氰菊酯蓄積量不斷升高，不同疊加處理組間蚯蚓的氯氰菊酯蓄積量差異顯著(P>0.05)。

圖1 不同污染方式處理組中蚯蚓體內氯氰菊酯含量

暴露35 d后，相同實驗濃度條件下，蚯蚓對疊加污染方式進入土壤的氯氰菊酯蓄積量均顯著高于一次污染方式(P<0.05)。與一次污染方式比較，蚯蚓更容易吸收蓄積以疊加方式進入土壤的氯氰菊酯。

2.3 蚯蚓對不同污染方式進入土壤的氯氰菊酯生物富集特征

蚯蚓脂肪質量分數為(3.55±0.31)%(以干質量計)，并結合生物富集實驗中蚯蚓體內氯氰菊酯蓄積量及土壤中氯氰菊酯殘留量的測定數據，計算皮質遠盲蚓-土壤蓄積因子(FBSA)，結果如表2所示，暴露21～28 d，蚯蚓對一次污染方式進入土壤的不同濃度氯氰菊酯的FBSA均緩慢上升；28 d時FBSA達到最大，但暴露35 d后，不同濃度處理組的FBSA持續下降并逐漸趨于穩定。氯氰菊酯以疊加污染方式進入土壤時，不同疊加次數處理組中蚯蚓對土壤中氯氰菊酯的富集程度在整個實驗暴露期間(0～55 d)一直在持續增加，表現為FBSA的不斷上升，暴露35 d后，不同疊加次數處理組中FBSA均高于同一實驗濃度的一次污染處理組。

表2 蚯蚓對土壤氯氰菊酯的蓄積因子(FBSA)

2.4 不同污染方式進入土壤的氯氰菊酯暴露對蚯蚓生長影響

不同污染方式處理條件下，氯氰菊酯暴露對蚯蚓生長的影響如圖2所示，氯氰菊酯實驗濃度為4 mg·kg-1，暴露21～55 d，不同污染方式處理組中蚯蚓的體質量與對照組差異并不顯著；氯氰菊酯實驗濃度為6 mg·kg-1，暴露21～28 d，不同污染方式處理組中蚯蚓的體質量顯著低于對照組(P<0.05)，但隨著暴露時間的增加，一次污染處理組中蚯蚓的體質量逐漸恢復，暴露35 d后已逐漸恢復至對照水平，而疊加污染處理組中蚯蚓的體質量在實驗暴露期間(21～55 d)均持續緩慢下降，顯著低于對照組(P<0.05)。氯氰菊酯對蚯蚓的生長影響與實驗濃度、暴露時間及進入土壤的方式有關(P<0.05)。

圖2 不同污染方式進入土壤的氯氰菊酯對蚯蚓生長的影響

3 討論(Discussion)

本研究采用一次和疊加2種污染方式，研究不同污染方式進入土壤的氯氰菊酯在土壤中的降解特征，以及皮質遠盲蚓對其生物富集的動態變化和蚯蚓生長所受影響。研究發現，以一次污染方式進入土壤的氯氰菊酯在土壤中的降解半衰期為27.7～28.9 d(表1)，低于報道的氯氰菊酯在土壤中的降解半衰期31.5 d[17]。氯氰菊酯為非極性殺蟲劑，在土壤中的降解是以微生物降解為主，化學降解為輔，土壤間理化性質的不同對其降解速率沒有明顯影響[18]。氯氰菊酯在土壤中降解加快的原因可能與蚯蚓的生物活動有關。有研究表明，蚯蚓可以通過吞食作用，在蚯蚓砂囊的機械研磨和消化道分泌酶聯合作用下，將有機污染物轉化為易于同化的碳水化合物，與土壤微生物協同作用加速對污染物的分解[19-21]，同時本實驗定期投放磨碎的干牛糞作為蚯蚓餌料，干牛糞富含粗蛋白等有機質，牛糞的添加也有利于土壤微生物的活動，因此，推斷氯氰菊酯在土壤中降解加快的原因是由于蚯蚓和土壤微生物對氯氰菊酯降解的協同作用。

與一次污染方式相比，相同實驗濃度條件下，以疊加污染方式進入土壤的氯氰菊酯在土壤中的降解相對較快(表1)，降解加快的原因可能與土壤微生物的誘導作用有關。有研究表明，農藥重復使用會對土壤微生物產生誘導作用，使其在土壤中的降解加快[22]。疊加污染的氯氰菊酯是以小劑量、多次疊加的方式進入土壤，隨著疊加次數的增加，對土壤微生物的誘導作用增強，有利于氯氰菊酯的降解，因此以疊加方式進入土壤的氯氰菊酯降解較一次污染加快。

研究發現，蚯蚓對不同污染方式進入土壤的氯氰菊酯吸收蓄積并不一致。相同實驗濃度條件下，蚯蚓對疊加污染方式進入土壤的氯氰菊酯蓄積量顯著高于一次污染方式(P<0.05)。與一次污染方式比較，蚯蚓更容易吸收蓄積以疊加方式進入土壤的氯氰菊酯(表2)。蚯蚓對不同污染方式進入土壤的氯氰菊酯蓄積差異可能與進入土壤的氯氰菊酯老化過程有關。老化是指污染物進入土壤后，土壤會對污染物發生吸附，吸附由最初的快速可逆吸附逐漸演變為長期慢吸附的過程[23]。污染物老化后，很難再發生解吸而殘留在土壤中，從而降低了污染物的生物有效性。污染物疏水性越強，與土壤接觸時間越長，其在土壤中的老化程度越大。研究表明，污染物老化程度越嚴重，越難被生物吸收[24-27]。如蚯蚓對新鮮土壤中莠去津、異丙隆和麥草畏等3種農藥的吸收蓄積量是老化土壤的2倍～10倍[28]。氯氰菊酯具有較強的疏水性[29]，與小劑量(2 mg·kg-1)多次疊加進入土壤的疊加污染方式相比，相同實驗濃度的氯氰菊酯以一次污染方式進入土壤時，和土壤接觸時間大于疊加污染，進入土壤的氯氰菊酯相對容易老化，蚯蚓難以對其吸收蓄積，導致蚯蚓體內氯氰菊酯蓄積量低于疊加污染的蓄積量。

FBSA是表征生物有機體在生長發育過程中，直接從土壤或從所消耗的食物中吸收并蓄積外來物質程度的參數[30]。氯氰菊酯以疊加污染方式進入土壤時，不同疊加次數處理組中蚯蚓對土壤中氯氰菊酯的富集程度在整個實驗暴露期間(0～55 d)一直在持續增加，表現為FBSA的不斷上升，暴露35 d后，不同疊加次數處理組中FBSA均高于同一實驗濃度的一次污染處理組，與蚯蚓體內氯氰菊酯的蓄積量變化一致(表3)。

污染環境中，蚯蚓可以通過減緩生長，減少對外源污染物的攝入實現自我保護[31]。在本研究中，筆者發現氯氰菊酯對蚯蚓的生長毒性與其實驗濃度及進入土壤的方式有關。當以一次或疊加污染方式進入土壤的氯氰菊酯處理濃度為4 mg·kg-1時，氯氰菊酯對蚯蚓生長均無明顯抑制，說明蚯蚓對低劑量的氯氰菊酯具有一定耐受性，而隨著氯氰菊酯實驗濃度增加，當氯氰菊酯實驗濃度為6 mg·kg-1時，暴露21～28 d，與對照組相比，一次和疊加處理組中蚯蚓均表現出顯著的生長抑制(P<0.05)，說明高濃度處理促進了蚯蚓對氯氰菊酯的吸收蓄積，當蓄積量超過了蚯蚓對氯氰菊酯的耐受性后，表現出對蚯蚓的生長毒性抑制。隨著暴露時間增加，由于不同污染方式進入土壤的氯氰菊酯老化差異，一次污染處理組中，蚯蚓對老化的氯氰菊酯吸收困難，導致其氯氰菊酯蓄積量下降，對蚯蚓的生長毒性減弱，暴露35 d后，蚯蚓體質量已逐漸恢復至對照水平，而疊加污染處理組中，蚯蚓的氯氰菊酯蓄積量和FBSA均顯著高于一次污染處理組，說明以疊加污染方式進入土壤的氯氰菊酯，更有利于蚯蚓對其進行生物富集，從而表現出較強的生長毒性。

研究發現，以不同方式(一次或多次疊加)進入土壤的氯氰菊酯，在土壤中的降解及其影響(蚯蚓)并不相同。與一次污染比較，以疊加方式進入土壤的氯氰菊酯，雖然在土壤中的降解速率加快，有利于其在土壤中的降解，但由于老化程度降低，也有利于蚯蚓對其進行生物富集，從而表現出較強的生物毒性。以疊加方式進入土壤的農藥污染物，是否會加劇對土壤生物的生態風險，還需要進行深入研究。目前，在農業生產中，氯氰菊酯等多數農藥的施用多為重復多次施用，實際土壤環境中的農藥污染，多為其低劑量多次施用逐步累積的污染結果。因此，在對土壤農藥污染的生態風險監測及評價中，應重視其疊加污染對土壤生物的風險研究。