磷酸三正丁酯對蚯蚓的生態毒性效應

王倩，楊揚,2，李梅,3,*

1. 南京大學環境學院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京 210023

2. 南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095

3. 南京大學環境學院，環境科學與工程國家級實驗教學示范中心，南京 210023

自2009年聯合國環境規劃署召開會議以來，溴代阻燃劑已在全球范圍內被禁用[1]。有機磷酸酯(OPEs)因具有低煙、低鹵、低成本以及阻燃性能好等特點，逐漸成為溴系阻燃劑的替代品[2-3]。近年來，在家具、建筑材料、紡織品、塑料制品和電子產品等方面得到了廣泛應用[4]，其產量持續增長。由于OPEs主要以物理添加而非化學鍵合方式加入到材料中，因此在使用、處置和回收過程中極易通過揮發、浸出和磨蝕作用而遷移至周圍環境[5]，造成我國OPEs污染日益嚴重。OPEs普遍分布在水體[6-7]、大氣[8]、室內灰塵[9]和沉積物[10]中，并可在生物體內積累到較高水平，最高可達15 000 ng·g-1脂質重量[11]。值得一提的是，有研究在北極的水體和沉積物中發現了OPEs的存在[12]。大量毒性試驗結果表明，OPEs能引起包括發育毒性、生殖毒性、神經毒性、內分泌干擾和致癌性等一系列生態毒理學效應[13-14]。如磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)和磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯(TDCIPP)可輕易進入血液、肝臟、腎臟和睪丸，并誘發腫瘤[15]，已被證明具有神經毒性和致癌性[16]。另有研究發現屋塵中的TDCIPP水平與男性甲狀腺激素(THs)水平降低和催乳激素水平升高密切相關[17]?？梢?，OPEs可能對生態環境和人體健康造成危害，因此研究OPEs的毒性效應具有重要意義。

根據取代基的不同，OPEs可分為氯代類、烷基類和芳香類[18-19]。其中，烷基取代OPEs是主要類型，在世界范圍內的野生動植物甚至人體內均有檢出[20-21]，在歐洲一些地區，魚體內烷基類OPEs濃度與多溴二苯醚相當[22]。常見的烷基類OPEs包括磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(TBOEP)、磷酸三乙基酯(TEP)、磷酸三(2-乙基己基)酯(TEHP)和磷酸三正丁酯(TnBP)[23]。TnBP是其中最常用的一種，被美國環境保護局(US EPA)劃歸為高產量(HPV)化學品[24]。據估計，全球TnBP的年產量為3 000～5 000 t，主要用作增塑劑、潤滑劑和阻燃劑[25]。同樣地，因使用廣泛，TnBP也在多種環境介質中被大量檢出。如從歐洲國家、菲律賓、加拿大和中國收集的海洋和淡水魚體內均檢測出TnBP，總含量范圍為1.43～6 000 ng·g-1脂質重量[23]。有研究分析了24個從中國東北遼河收集到的地表沉積物樣品，發現遼河TnBP污染嚴重[26]。此外，土壤作為陸地生態系統的基礎，其TnBP污染同樣不容忽視。有研究表明，土壤是疏水性有機化合物TnBP的重要貯存介質。鄧旭等[27]在中國成都市區/郊區土壤中檢測出較高水平的TnBP。Cui等[3]收集并分析了67份來自中國廣州亞熱帶城市道路綠化帶、稻田、公園、商業和居民區的土壤樣品，發現廣州市郊土壤中的OPEs濃度范圍為0.041～1.37 mg·kg-1，且所有樣品中均有TnBP檢出。He等[28]檢測了中國重慶市街道粉塵中OPEs的含量，發現其濃度范圍為0.35～1.37 mg·kg-1。Wang等[29]在大連收集了49個表層土壤樣品，并對其濃度和組成進行鑒定，發現土壤中TnBP較為豐富，占總OPEs的28.5%±15.6%。幾項毒理學研究表明TnBP可能對動物和人體健康產生多種不利影響。如TnBP可降低亞洲淡水蛤(Corbiculafluminea)中抗氧化酶和熱激蛋白相關基因的水平[30]。Hou等[31]研究發現，TnBP可在稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)腎臟、卵巢和肝臟中蓄積。高丹等[32]考察了TnBP對斑馬魚胚胎的急性和慢性毒性，發現胚胎孵化率、存活率、心率和體長與受試物濃度呈負相關，而異常率則呈正相關。

鑒于TnBP分布廣泛且具有一定毒性，可能對生態系統造成巨大威脅，因此其潛在風險值得關注。相較于水生生態系統，TnBP在土壤生態系統中的研究非常有限，目前僅局限于TnBP在土壤環境中的檢測[3]，而其造成的土壤環境風險尚未得到恰當評估，對土壤生物的毒性效應也知之甚少。蚯蚓作為“生態系統的工程師”，對維持土壤生態系統功能有著不可替代的作用，且處于食物鏈底端，已成為對陸地環境有毒物質進行生態風險評價的重要指示生物[33]。綜上，本文選擇用量大且應用范圍廣泛的TnBP為研究對象，選取土壤模式生物赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)為受試生物，通過TnBP對蚯蚓的急性暴露實驗，以蚯蚓的生長、抗氧化酶、乙酰膽堿酯酶活性和遺傳毒性指標的響應變化，來探究TnBP對蚯蚓的毒性效應，進而為后續進行土壤生態風險評估提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

磷酸三正丁酯(tri-n-butyl phosphate, TnBP)為化學純，CAS號為126-73-8，購自蘇州泰普瑞精細化學品有限公司；石英砂(CAS No.14808-60-7)、高嶺土(CAS No.1332-58-7)，純度均為99%，碳酸鈣(CaCO3)，為分析純，均購于南京化學試劑有限公司；牛糞購自內蒙古錫林郭勒草原有限公司，經烘干過20目篩備用；生理鹽水即0.9%的氯化鈉(NaCl)溶液，NaCl(CAS No.7647-14-5)為分析純，購自南京化學試劑有限公司。

赤子愛勝蚓(E.fetida)由江蘇省句容蚯蚓養殖基地提供，挑選環帶明顯且無損傷，體重介于0.3～0.6 g的成蚓，試驗前于清潔人工土壤中馴化24 h，供試驗用。

1.2 試驗方法

采用人工土壤法研究TnBP對蚯蚓的毒性效應。人工土壤配制參照經濟合作與發展組織(OECD)推薦的標準方法[34]，并做適當改進。具體配制過程如下：稱取350 g石英砂，100 g高嶺土以及50 g過20目篩的干牛糞于培養缸中，充分混勻。加入175 mL經蒸餾水稀釋為不同濃度的TnBP溶液，混勻后使各處理組最終濃度分別為0、0.1、1和10 mg·kg-1，各培養缸中含水量為35%，并用CaCO3調節pH至6.0±0.5。每個處理6個平行，置于恒溫恒濕培養箱穩定7 d，隨后，每缸放入10條經清潔人工土壤馴化24 h后的蚯蚓培養14 d，用錫箔紙封口并扎小孔透氣。培養箱溫度設置為(20±2) ℃，濕度保持80%左右，光照條件設為12 h光照和12 h黑暗一個循環(光照強度為400～800 lux)。于第3天、第7天和第14天，分別記錄蚯蚓體重、死亡數及中毒癥狀，并在每個玻璃培養瓶中隨機取出3條用于后續分析。

1.3 體重變化率測定

在第3天、第7天和第14天時將不同處理組蚯蚓的平均體重與第0天進行比較，采用如下公式計算體重變化率：

體重變化率=(Wt-W0)/W0×100% (1)

式中：Wt為第t天蚯蚓的平均體重(mg)，W0為第0天蚯蚓的平均體重(mg)。

1.4 生化指標測定

1.4.1 酶液制備

將經過染毒處理的蚯蚓清腸24 h，每組選擇3條進行組織液制備。將蚯蚓洗凈、稱重，放入10 mL圓底離心管中，按重量(g)∶體積(mL)=1∶4比例加入生理鹽水，冰浴條件下機械勻漿，3 000 r·min-14 ℃離心10 min，取上清液即為20%酶液，一部分用于丙二醛(MDA)含量測定，另一部分再分別稀釋得到10%和5%組織勻漿，用于超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、乙酰膽堿酯酶(AChE)活性和8-羥基鳥苷(8-OHdG)含量測定。

1.4.2 酶活性測定方法

蛋白含量采用BCA(bicinchonininc acid)法蛋白定量測試盒(南京建成提供)進行測定。SOD、CAT和AChE活性均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，按說明進行測定。其中，SOD活性以450 nm下吸光值計算，酶活性單位定義為反應體系中SOD抑制率達50%的酶量；CAT活性以405 nm處吸光值計算，單位為U·mg-1prot；AChE活性以412 nm處吸光值計算，以水解反應體系中1 μmol基質為1個活力單位。測定時每個處理設3組平行，每個平行重復測定3次。

1.4.3 MDA含量和8-OHdG含量測定方法

MDA含量和8-OHdG含量按照試劑盒方法進行測定，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。MDA含量測定過程中，酶液直接用于測試，于波長532 nm處測定吸光度值；8-OHdG含量測定時將酶液稀釋為10%的組織勻漿進行，于波長450 nm處測定吸光度值。

1.5 DNA損傷

在暴露的第3天、第7天和第14天，隨機從各處理組取出3條蚯蚓，清腸24 h后洗凈，參考Eyambe等[35]方法提取蚯蚓體腔細胞，制備單細胞凝膠電泳膠板，經裂解、解旋后，在電壓25 V，電流300 mA條件下避光電泳20 min。中和堿性后，染色，置于熒光顯微鏡下觀察，并用數碼相機拍照。用Comet Assay Software Project (CASP)分析軟件進行分析，選取尾DNA含量(Tail DNA%)和Olive尾矩(Olive tail moment, OTM)2個參數作為DNA損傷的指標，每張片子分析50個細胞。

1.6 數據分析

數據處理采用軟件SPSS18.0進行統計分析，并用OriginPro 2015軟件繪圖。所有實驗結果采用平均數±標準差(Means±SD)表示，利用Student’s t-test檢驗2組樣品所測指標平均數的差異是否具有統計學顯著性，以P<0.05作為顯著性標志。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 TnBP暴露對蚯蚓死亡和體重的影響

赤子愛勝蚓暴露于TnBP后第3天、第7天和第14天的死亡與生長情況如表1所示。由表1可知，TnBP暴露期間，蚯蚓未觀察到明顯的死亡現象(死亡率均未超過5%)，說明在人工土壤環境下，本實驗設置濃度范圍對蚯蚓不具有明顯致死效應，TnBP急性毒性較弱。而不同濃度的TnBP處理組中，蚯蚓體重隨暴露時間延長而持續增加，并在第14天達到試驗周期體重的最大值，體重增長率變化范圍為34.6%～81.1%(圖1)，表明人工土壤的營養條件滿足蚯蚓的生長需求，且TnBP急性毒性較低，未對蚯蚓生長產生明顯抑制。Yang等[36]的研究也有類似結果，暴露于TCEP和TCP的蚯蚓未出現明顯死亡，且蚯蚓體重隨時間的延長持續增加。

表1 磷酸三正丁酯(TnBP)暴露下蚯蚓死亡率

圖1 不同暴露時間TnBP對蚯蚓體重變化率的影響

2.2 TnBP暴露對蚯蚓抗氧化酶活性的影響

圖2 TnBP暴露下蚯蚓組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性(a)和過氧化氫酶(CAT)活性(b)

當遭受污染物脅迫時，蚯蚓體內抗氧化酶受到非常復雜的調控，往往不是單一的酶發揮作用，并且其活性變化與暴露劑量和時間均密切相關[44]，SOD和CAT活性的上升是對TnBP暴露所產生ROS的直接響應，用于清除污染物產生氧化脅迫導致的過量自由基，以適應環境變化，保障機體各種生理功能有條不紊地進行。Chen等[2]研究了2種常見有機磷酸酯阻燃劑，磷酸三苯酯(TPP)和磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)對5周齡雄性小鼠氧化應激的影響，發現經TPP和TCEP處理后，肝臟中SOD活性增強，CAT的活性則以劑量依賴性方式增加，與本實驗結果一致。Meng等[45]也發現經TPP處理可以增強貽貝血細胞SOD和CAT的活性，以及它們各自基因的轉錄水平。

2.3 TnBP暴露對MDA含量的影響

氧化應激可能導致細胞膜損傷和其他毒性作用[46]。MDA作為一種由自由基引發的次級脂質氧化產物，其含量反應了生物機體脂質受氧化損傷的程度[47]。在正常生理狀態下，蚯蚓體內MDA含量較低，而當外源污染物脅迫產生的氧自由基，在體內抗氧化防御系統清除不及時，會導致機體MDA含量明顯升高。不同濃度TnBP暴露下，蚯蚓體內MDA含量變化如圖3所示。由圖3可知，隨著暴露時間的增加，MDA含量逐漸累積，且在暴露的第7天和第14天，蚯蚓體內MDA含量較對照組顯著上升(P<0.05)，為對照組的1.44～1.67倍；而隨著TnBP濃度升高，除在第3天高濃度組(10 mg·kg-1)MDA含量較前一濃度出現下降趨勢外，其他各組MDA含量均隨TnBP濃度的升高而上升，并與對照組相比差異顯著，表明SOD和CAT活性雖在TnBP暴露下有所增強，但不能保護蚯蚓免受過氧化影響，蚯蚓受到一定程度的氧化損傷，導致體內次級脂質過氧化產物MDA含量上升。第3天MDA含量的下降可能是高濃度脅迫下短期內激發了多種抗氧化酶的防御，使得氧化損傷作用較低濃度組有所緩解。與此類似，Chen等[2]研究了TPP暴露對小鼠氧化應激狀況的影響，結果顯示，經TPP暴露后，小鼠肝臟MDA含量顯著增加，并存在一定劑量依賴性，與本實驗結果一致。在本試驗中，TnBP暴露引起蚯蚓明顯的脂質過氧化效應，且總體來說，隨著濃度升高，蚯蚓受氧化損傷的程度加重。

圖3 TnBP暴露下蚯蚓組織中丙二醛(MDA)含量

2.4 TnBP暴露對蚯蚓DNA損傷的影響

彗星試驗，又名單細胞凝膠電泳技術，是目前檢測污染物對生物體遺傳毒性常用方法之一[48]。已有研究證實OPEs暴露能引起蚯蚓體腔細胞的DNA損傷[36]，表明OPEs具有遺傳毒性[49]。3種不同濃度TnBP暴露下蚯蚓體腔細胞中Tail DNA含量和OTM的變化如圖4所示。結果顯示，在暴露的第3天和第7天，低濃度TnBP處理組(0.1 mg·kg-1)蚯蚓體腔細胞中Tail DNA含量和OTM較對照變化不顯著(P>0.05)，而在暴露的第14天，Tail DNA含量與對照組相比顯著上升(P<0.05)，提示體腔細胞中DNA受到損傷。當濃度升高至1 mg·kg-1和10 mg·kg-1時，在暴露第3天，Tail DNA含量和OTM出現顯著上升并隨濃度的增加呈現上升趨勢，這可能是因為隨著濃度的升高，TnBP脅迫下在蚯蚓體內產生的ROS及其他中間產物增加，造成細胞DNA損傷程度的加大。這些結果與Yan等[50]的一致，該研究報道了TnBP暴露會引起河蜆(Corbiculafluminea)DNA損傷，且由TnBP誘導的DNA損傷程度以劑量依賴性方式增加。相似地，Chen等[51]的研究也表明TDCIPP暴露會造成稀有鮈鯽肝臟中DNA的損傷，并呈劑量依賴性。隨著暴露時間的增長，高濃度組(10 mg·kg-1) Tail DNA含量在第7天最高，為22.13%，在第14天呈下降趨勢，其原因可能是在高濃度TnBP脅迫下，蚯蚓的自我修復機制發揮作用[52]，OTM則在1 mg·kg-1暴露14天時達到最高值。

圖4 TnBP暴露下蚯蚓脫氧核糖核酸(DNA)損傷：Tail DNA含量(a)和Olive尾矩(OTM) (b)

有研究表明ROS引起的氧化應激可導致DNA損傷[53]，OPEs誘導的DNA損傷與氧化應激之間的關聯已在流行病學[54]和動物實驗[49]中有所報道。推測在本試驗中，TnBP暴露造成蚯蚓體細胞DNA損傷可能也是通過氧化應激引起的。近年來，因鑒定了8-OHdG水平與氧化性DNA損傷和癌癥發病率之間的相關性，8-OHdG已被廣泛用作氧化應激和致癌的生物標記物，其含量變化通常作為描述ROS對DNA損傷程度的指標。本研究分析了不同濃度TnBP暴露下，蚯蚓體內8-OHdG含量的變化(圖5)。由圖5可知，在暴露的第3天，蚯蚓體內8-OHdG含量無明顯積累，而到第7天和第14天時，即使在低濃度TnBP暴露條件下，8-OHdG的水平也顯著上升，且其含量與TnBP暴露濃度存在明顯的劑量-效應關系。由此可見，TnBP暴露雖會引起蚯蚓體內抗氧化酶系活性上升，但卻不能完全清除ROS，從而造成DNA損傷。Chen等[51]在研究OPEs遺傳毒性時發現，TDCIPP暴露會引起稀有鮈鯽肝臟細胞中8-OHdG含量顯著上升，且TDCIPP誘導的DNA損傷歸因于氧化性DNA損傷，與本研究結果一致。相同濃度各處理組在整個染毒周期8-OHdG含量呈現先減小后增加的趨勢，可能是因為經14 d暴露雖然8-OHdG在蚯蚓體內有所累積，但其含量的增加并非是一個簡單的線性曲線，機體自身對DNA損傷具有修復作用，因而在第7天含量有所下降，但卻不能被完全修復，這導致在第14天繼續增加[55]。

圖5 TnBP暴露下蚯蚓組織中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)含量

2.5 TnBP暴露對蚯蚓AChE活性的影響

AChE是催化神經遞質乙酰膽堿的一種關鍵酶[56]，數十年來，其活性被廣泛認為是神經毒性的生物標志物[57]。本研究發現TnBP暴露對蚯蚓AChE活性影響較為微弱，在第7天AChE活性似乎略有下降，但無統計學意義(圖6)。Sun等[58]在研究TnBP對斑馬魚的神經毒性時，也未發現AChE活性變化，但TnBP可影響斑馬魚幼魚行為，通過非乙酰膽堿途徑使幼魚游泳速度下降，產生神經毒性，并抑制幼魚神經發育關鍵基因髓磷脂堿性蛋白基因(mbp)和突觸蛋白基因(syn2a)的表達；類似地，顧杰等[59]研究發現，TPP、2-乙基己基二苯基磷酸酯(EHDPP)和TCEP暴露能顯著抑制斑馬魚幼魚mbp和syn2a的轉錄，通過氧化應激和下調神經發育關鍵基因的轉錄，從而導致神經毒性。Jiang等[60]的研究結果表明，TnBP能對蚯蚓產生神經毒性。在本研究中，TnBP暴露對蚯蚓AChE活性影響較為微弱，可能是因為TnBP也是通過非乙酰膽堿途徑誘導神經毒性，其具體影響機制有待進一步探究。

圖6 TnBP暴露下蚯蚓組織中乙酰膽堿酯酶(AChE)活性

綜上所述，不同濃度TnBP暴露對蚯蚓死亡與生長沒有顯著影響，但可誘導蚯蚓體內SOD酶活性和CAT酶活性增強，可能通過非乙酰膽堿途徑誘導神經毒性，即使是低濃度TnBP暴露，也能導致蚯蚓體內MDA含量顯著增加，引起蚯蚓脂質過氧化與DNA損傷。這些結果有助于了解TnBP暴露對蚯蚓的毒性效應及毒性作用機理，豐富了OPEs污染對土壤生物影響的認識，并為評估土壤生態系統中OPEs的風險提供了重要信息。