畜牧場中磺胺類抗生素及其抗性基因的空間分布規律

綦崢，楊紅，張鐵林，齊越，凌娜

哈爾濱商業大學藥物工程技術研究中心，哈爾濱 150076

我國每年生產抗生素21萬t，其中48%用于農牧業[1]。畜禽養殖業中抗生素高濃度殘留現象已成為社會關注的熱點問題[2]。研究表明，大多數進入動物體內的抗生素不能被其自身完全吸收，30%～90%的抗生素通過畜禽排泄物或動物糞便排出，從而導致了土壤中抗生素殘留的持續污染[3]。抗生素殘留可誘導抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的產生，通過注射抗生素會導致其動物糞便中抗生素耐藥基因的產生[4]。磺胺類抗生素(sulfonamides, SAs)在農牧業中的使用量很高，尤其在畜禽糞便中SAs的檢出率也非常高[5]。在江蘇省13個城市的80份豬場糞便樣本中，磺胺二甲嘧啶(SMD)的檢出率最高，達到50%以上，磺胺氯噠嗪(SPD)和磺胺嘧啶(SD)檢出率都高于30%，三者的平均殘留量分別為34.0、49.0和69.0 μg·kg-1[6]。殘留的SAs藥物對土壤中的微生物及微生物群落有重要的抑制作用[7]。SAs在牧區中的普遍使用，將導致耐藥菌和ARGs在土壤環境中和動物之間傳播，從而引起環境領域的廣泛關注[8]，同時ARGs也被公認為一種新的污染物[9]。

為了解畜牧場內SAs及ARGs的污染物空間分布情況、分布規律及相關性，為畜牧場土壤的修復提出參考依據，本研究選取大慶市杜爾伯特蒙古自治區(以下簡稱杜蒙)作為研究對象，該畜牧場位于中國東北黑土地區，東北的黑土地區是目前世界上珍貴的三大黑土資源之一，以其有機質含量高、土壤肥沃和最適宜耕作而聞名于世，素有“谷物倉庫”之稱[10]。杜蒙地區擁有眾多大小畜牧場，同時也是重要的奶源基地。本研究采用液相色譜-串聯質譜法和實時熒光定量PCR法對該畜牧場土壤及糞便中的SAs含量及其ARGs豐度進行定量檢測，對其空間分布規律以及SAs對磺胺類ARGs選擇壓力的相似性進行分析。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 樣品采集

杜蒙位于黑龍江省西部，嫩江下游東岸。西鄰泰來縣，南與肇源縣毗鄰，北與齊齊哈爾市接壤[11]。采樣的畜牧場為典型的東北牧區(圖1)。該地區氣候屬于溫帶大陸性氣候，冷暖適中，四季分明。研究區土地類型上部為黑色腐殖土、黃土和松砂層，下部為灰褐和黑色粘土。底部為灰白、黃灰色砂層和砂礫層，沉積厚度118 cm左右[12]。牧區總面積約為67 km2，其中畜牧場(存欄量約為200頭)，在當地屬于中型畜牧場。

圖1 杜蒙某畜牧場采樣區

在畜牧場采用網格式布設預采樣點，運用荷蘭鉆304不銹鋼土樣采集器，在網格內選取土壤采樣點10個(紅色圓點)，采樣深度分別為10 cm和50 cm(圖2)，以及糞便樣品5個(黃色圓點)。用GPS定位并記錄，土壤樣品各500 g，在每個采樣點1 m2內取3個土壤樣品，混勻后待檢測。糞便樣品每份500 g，裝入牛皮紙密封袋中，保存在冰袋中冷藏。

圖2 現場土壤和糞便采樣分布點

1.2 樣品檢測

1.2.1 抗生素檢測方法

采用液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)，對土壤中的磺胺類包括磺胺醋酰(SA)、磺胺氯噠嗪(SPD)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲氧嘧啶(SEP)、磺胺脒(SG)、磺胺二甲嘧啶(SMD)、磺胺甲噻二唑(SDS)、磺胺甲惡唑(SMZ)、磺胺苯吡唑(SPP)、磺胺吡啶(SP)、磺胺噻唑(ST)、磺胺苯酰(SBA)和磺胺鄰二甲氧嘧啶(SDM’)共13種抗生素濃度進行檢測。

稱取1.00 g新鮮土壤樣品(糞便樣品)于10 mL試管中，以EDTA-Mcllvaine緩沖提取液提取3次，渦旋振蕩超聲離心，HLB小柱凈化富集，3 mL甲醇洗脫后，氮吹至近干，1 mL甲醇復溶震蕩，過0.22 μm有機系濾膜，經LC-MS/MS檢測，色譜和質譜條件如表1所示。同時，每組另加2個全程序空白平行樣，以校正各待測化合物在土壤基質中存在的不可忽略的基質效應。

表1 液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)的色譜和質譜條件

1.2.2 抗性基因檢測方法

(1)DNA提取

樣品中的基因組提取使用的試劑盒為TIANNAMP Soil DNA Kit(天根生化科技有限公司，中國)，按照說明書要求進行提取。

(2)實時熒光定量PCR檢測

測定樣品中3種磺胺類抗性基因sul1、sul2和sul3的多樣性和豐富度，采用試劑盒TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ測定，qPCR的反應體系如表2所示。qPCR的反應條件：95 ℃ 30 s，一個循環。95 ℃ 5 s，40個循環。60 ℃ 30 s，40個循環。16S rRNA基因作為內參基因。相對豐度的計算采用2-ΔΔCT的方法進行計算，其中△CT=CT(目的基因)-CT(內參基因)[13]。

表2 qPCR反應體系

1.3 數據處理

數據通過Excel2016進行處理，采用ArcGIS10.5繪制SAs的空間分布規律圖，Origin8.0對SAs濃度和ARGs相對豐度進行分析，利用Cluster3.0和Heatmap繪制熱圖，對SAs和ARGs進行聚類分析。

2 結果(Results)

2.1 磺胺類抗生素的空間分布規律

13種SAs在糞便及10 cm和50 cm的土層中濃度分布情況(圖3)。整體上，土壤樣品中的濃度分布不均勻，在糞便中，SEP、SMD、SPP、SBA和SDM’的檢出率達到100%，抗生素的平均濃度為0.060～8.167 μg·kg-1；在10 cm土層中，SPP的檢出率達到100%，抗生素的平均濃度為0.003～16.097 μg·kg-1；在50 cm土層中，SEP、SBA和SDM的檢出率都達到100%，抗生素的平均濃度為0.002～6.981 μg·kg-1。其中，SPP是土壤中殘留濃度最高的SAs，SPP在所有被檢測的土壤樣品中的檢出率均高于96.7%，SPP在糞便中的濃度也最高。隨土壤深度增加，SAs殘留濃度減小，SAs在糞便樣品和不同土層的濃度變化趨勢與張昊[14]的研究結果相似，表明畜牧場土壤中SAs的來源很可能是畜禽糞便在畜牧場內的累積造成的。

圖3 13種磺胺類抗生素(SAs)在糞便和不同深度土壤中的濃度

土壤中13種SAs的空間分布特征如圖4所示，從污染物空間分布特征來分析可知：從垂直方向上，隨著土壤深度的加深，土壤中SAs的濃度逐漸減小，呈下降趨勢。在水平方向上，10 cm土層中SPP、SA、SG和SBA的空間分布結構相似，從西向東，污染特征呈逐漸減小的趨勢，且主要污染集中在東部地區；SPD、SP和SMZ在10 cm土層的分布結構相似，污染特征主要集中在東北部；50 cm土層中SA、SG、SMZ、SPP、SDM、SD和ST的空間分布結構相似，從西向東污染程度逐漸增大，主要集中在東南部地區；整體水平上SAs在10 cm土層中由西到東空間分布污染情況逐步減小，主要聚集區域為畜牧場的西部，50 cm土層中，從西向東，污染特征逐漸增大，主要污染聚集區域為東北部地區，其余區域均無明顯聚集現象。

圖4 SAs污染的空間分布GIS圖

2.2 磺胺類ARGs的相對豐度分布情況

3種磺胺類ARGs在10 cm和50 cm的土層中相對豐度分布情況如圖5所示。整體上，土壤樣品中的相對豐度含量分布不均勻，在10 cm土層中，sul1和sul2的檢出率達到100%，ARGs的相對豐度范圍為0.0043～0.2282；在50 cm土層中，3種ARGs的檢出率都達到100%，ARGs的相對豐度范圍為0.0013～0.1499。其中，sul2是土壤中殘留含量最高的磺胺類ARGs，在10 cm土層中的相對豐度含量最高，隨土壤深度增加，磺胺類ARGs相對豐度逐漸減小。這與貴州省養豬場的情況有所不同，在寇宏等[15]的研究中sul3是攜帶率較高的磺胺類ARGs。

圖5 磺胺類抗生素抗性基因(ARGs)在不同土層中的相對豐度

2.3 磺胺類抗生素及抗性基因的相關性分析

對13種SAs和3種磺胺類ARGs (sul1、sul2和sul3)進行聚類分析，熱圖的縱向代表ARGs的相對豐度，橫向代表13種SAs的聚類情況，反映了SAs對磺胺類ARGs是否有選擇壓力的相似性，從圖6可知，SD、SMD、SP和SPP聚為一類，SPD、SEP、SMZ、SA、SDM和SBA聚為一類；SG、SDS和ST聚為一類。說明SD、SMD、SP和SPP對磺胺類ARGs的壓力作用相似；SPD、SEP、SMZ、SA、SDM和SBA對磺胺類ARGs的壓力作用相似；SG、SDS和ST對磺胺類ARGs的壓力作用相似。

圖6 土壤中SAs及ARGs的聚類分析

3 討論(Discussion)

畜牧場土壤中SAs的使用加速了其ARGs的累積，目前ARGs的相對豐度與土壤中的菌群影響研究很多，結果單一相關性很低，因此，土壤中ARGs的生成是土壤中微生物、畜牧場中動物腸道菌群和土壤性質等因素的共同協作結果[16]。探究畜牧場土壤中SAs及ARGs的空間分布規律，為土壤修復和污染防治提供借鑒。

SAs在畜牧場土壤中廣泛存在，從空間分布的污染情況可知，垂直方向上，SAs的濃度由上至下逐步升高，其中，SPP的平均濃度最高為8.167 μg·kg-1；水平方向上，10 cm土層和50 cm土層的抗生素整體濃度水平不高，主要聚集在畜牧場的東南部，在畜牧場的西南方向有小部分聚集。西南區域是成牛的主要活動區，東南方向是小牛的主要活動區，因此出現了2個較為明顯的抗生素殘留聚集區。從SAs濃度的分布情況可知，糞便中SAs的檢測濃度高于土壤中的濃度。這與沈群輝[17]的研究結果相同，無論是養牛場、養雞場或是養豬場，糞便中SAs的檢測濃度均高于周邊土壤中的濃度。

結果表明，抗生素的殘留是導致土壤中磺胺類ARGs產生的主要原因之一，也是潛在ARGs的攜帶者。越來越多的研究表明，過量使用含有抗生素的殘留物會顯著增加土壤中的ARGs含量。抗生素殘留量與ARGs相對豐度呈顯著相關性[18-19]。不同的耐藥菌影響了土壤中ARGs的分布和基因相對豐度，從而形成了不同的土壤中抗生素及其ARGs的空間分布特征[20-21]。土壤的性質和有機質濃度等環境因素也會影響ARGs的分布[22-26]。因此，對SAs及其ARGs在土壤中的危害問題仍有待進一步的實驗研究，為今后土壤環境污染修復提供參考。

綜上所述，本研究結果表明：

(1)土壤中13種SAs在土壤和糞便樣品中均有檢出，其垂直濃度的空間分布規律為糞便>10 cm深度土壤>50 cm深度土壤，空間分布污染特征主要集中在畜牧場的東南部。

(2)土壤中3種ARGs在10 cm和50 cm深度土層中均有檢出，其基因相對豐度分布情況為10 cm深度土壤>50 cm深度土壤，且SAs對ARGs的壓力作用呈現相似性。

(3)土壤中SAs及其ARGs的空間分布規律和SAs對ARGs壓力作用的相似性分析，為深入研究畜牧場周邊環境中ARGs的傳播規律提供基礎數據。