血清miRNA-126水平與乙肝肝細胞癌血管生成擬態的關系

沈 宏，成麗婭，宗春輝，馬 程，趙冬雨

肝癌是我國發病率第4位的腫瘤，其中乙肝相關肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占我國肝癌總數的80%～90%[1]。近年來研究發現，血管生成擬態(vasculogenic mimicry, VM)與HCC的轉移、復發、生存期縮短等不良預后密切相關[2,3]。探索VM發生的相關影響因素并作為HCC預后判斷的標志物的研究已成為熱點[4]。多種microRNAs(miRNA)被證實在HCC進展、轉移和免疫紊亂中起到作用[5,6]。既往研究發現miRNA-126與血管完整性和血管生成相關疾病有關[7]。miRNA-126水平下調也被發現與HCC轉移、患者生存率下降密切相關[8]。然而目前關于miRNA-126與血管生成擬態在HCC患者預后中的關系的研究未完全明確?；诖耍狙芯糠治隽烁伟┗颊吆徒】祵φ战M血清中miRNA-126水平差異，并通過肝癌組織切片染色探索了血清miRNA-126與VM的關系，以期為將來HCC患者預后判斷和早期干預提供新的參考。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2016-10至2019-10在天津市中西醫結合醫院和武警特色醫學中心住院接受根治性肝切除術的183例乙肝相關早期肝細胞癌患者作為研究對象(HCC組)。納入標準：(1)巴塞羅那分期為Ⅰ-Ⅱa期，住院接受根治性肝癌切除術，術前乙肝病史明確，術后病理證實為HCC[1]；(2)未接受免疫治療；(3)有完整的數據記錄；(4)無其他主要臟器疾病和功能障礙。排除標準：(1)繼發性肝癌；(2)其他惡性腫瘤；(3)乙肝合并丙肝者。收集天津市中西醫結合醫院健康體檢者183例作為正常對照組。本研究經武警特色醫學中心倫理委員會批準。

1.2 血清樣本采集和保存 收集HCC患者和對照組的靜脈血5 ml。靜止沉淀后以43 000 r/min離心10 min，保留血清，并儲存于-80 ℃冰箱中。血清樣品采集和保存過程中，盡量縮短暴露時間，以防止RNA降解。

1.3 實時定量PCR 根據說明用miRNasy Mini Kit試劑盒提取血清中的總RNA。用紫外分光光度計在260 nm和280 nm處的吸收值，測定總RNA的濃度和純度。通過PCR擴增反轉錄合成cDNA模板，用ABI7500定量PCR儀通過RT-PCR技術擴增目的基因。miRNA-126正向引物序列為CTGCTCGACCTCGGAAACTATG。PCR結果用Opticon Monitor 3軟件進行分析。

1.4 臨床資料收集 收集納入患者的年齡、性別、肝癌BCLC分期、吸煙史、飲酒史、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、肝硬化程度、MVD和術前AFP水平，肝纖維化的Ishak分期。術前CT或MRI影像學資料。

1.5 病理組織染色 HCC組的肝癌組織由病理科進行組織切片常規HE染色(圖1A)。HE染色后在顯微鏡下判斷標本的VM情況。腫瘤邊界為腫瘤細胞，非內皮細胞，未見出血、壞死或炎性細胞浸潤則判斷為HE染色下VM可疑陽性。對VM可疑陽性組織切片再進行CD34-PAS雙重免疫組織化學染色。鏡下觀察：CD34染色陽性為血管內皮細胞的細胞膜或(和)細胞質呈棕黃色顆粒。VM陽性標準：由PAS陽性環周圍的腫瘤細胞組織，周圍無內皮細胞，管腔內無紅細胞。簡言之，PAS陽性和CD34陰性的網絡結構定義為腫瘤組織VM陽性(圖1B)，而CD34染色陽性則判斷為VM陰性(圖1C)[9]。

圖1 肝細胞癌組織病理染色(×200)

微血管密度(microvessel density, MVD)計數：在100倍視野下，選擇確定內皮依賴性血管集中的區域。微血管由單個或成簇的棕色CD34陽性內皮細胞組成。隨機選擇3個200倍視野計算血管總數為MVD。

2 結 果

2.1 一般資料比較 研究納入的HCC組和對照組患者在性別、年齡、吸煙史和飲酒史差異無統計學意義(P>0.05)。HCC組患者的血清miRNA-12表達水平低于對照組(P=0.000，表1)。

表1 HCC組和對照組患者一般資料比較

2.2 肝細胞癌組織中VM陽性表達的相關因素 HCC患者中VM陽性組與VM陰性組在腫瘤大小、分化程度、TNM分期、Ishak 分期Ⅴ-Ⅵ期、MVD、術前AFP、血清miRNA-126表達水平等方面均存在統計學差異(表2)。

表2 VM陽性組與VM陰性組HCC患者資料比較

2.3 HCC患者發生VM的危險因素分析 使用Logistic回歸分析發生VM的影響因素可見，HCC患者術前的血清miRNA-126低表達、AFP升高、腫瘤大小是出現VM的相關因素(表3)。

表3 HCC患者發生VM的危險因素分析

2.4 不同因素預測VM發生的ROC分析 分別使用血清miRNA-126低表達、AFP升高、腫瘤大小指標構建預測VM發生的ROC分析可見，術前miR126水平預測VM的曲線下面積為0.869(95%CI：0.815-0.924)，最佳診斷切點為0.43，敏感度為83%，特異度為81%；AFP預測VM的ROC線下面積為0.796(95%CI：0.728～0.864)，腫瘤大小預測VM的ROC線下面積0.755(95%CI：0.683～0.828)，見圖2。

圖2 HCC患者術前不同因素預測VM發生的ROC曲線

3 討 論

miRNAs是一類長度為20-25nt的非編碼RNA，其對靶基因的轉錄后調控起著關鍵作用[10]。miRNAs可作為腫瘤細胞的功能效應器，在調節腫瘤進展、轉移和免疫紊亂等方面發揮著多方面的作用[11,12]。近年來，對于miRNAs在HCC中作用的研究也越來越多，目前多項研究已經發現miRNA-126與肝癌的增殖、遷移和侵襲密切相關[13]，并明確了miRNA-126下調可以促進肝癌細胞的轉移，影響肝癌患者的預后[8]。我們比較了HCC患者和體檢對照組患者的血清miRNA-126水平發現，HCC患者miRNA-126表達水平明顯低于正常對照組。既往研究表明miRNA-126和PLK-4的聯合作用在HCC的發生發展中起著至關重要的作用[14]，然而先前的研究并未對VM與miRNA-126相關性進行過分析，我們采用病理相結合方式分析了miRNA-126與患者VM的關系。

HCC患者發生VM被認為是加劇腫瘤的轉移、復發、預后不良的重要因素[15]。因此若早期、無創發現VM，則對HCC患者預后判斷提供一定幫助，更有利于臨床決策。筆者采用患者術前資料和術后病理相結合進行分析，使用Logistic回歸分析發現miRNA-126可作為VM發生的一個相關因素。盡管尚不清楚miRNA-126與VM的相關性是否存在因果關系，但既往研究提示miRNA-126-3p的表達下調可促進肝癌的血管生成和轉移，并認為miR-126-3p表達的恢復可能在HCC治療方面提供新思路[16]。也有學者發現腫瘤患者miRNA-126與微血管的數量存在一定相關性[17]。也有體內研究證實了通過調控miRNA-126能夠抑制裸鼠皮下腫瘤生長,這為針對miRNA-126進行基因治療靶點提供了一定可能性[18]。盡管目前有多個研究證實了miRNA-126與多個實體腫瘤的內皮細胞、血管生長因子、新血管生成等不同方面關系密切，但僅限于肺癌、乳腺癌和卵巢癌等研究[17,19,20]，尚缺乏對HCC患者的相關基礎和臨床研究，這也是今后的一個研究方向。

此外，術前miRNA-126無創預測VM的敏感性特異性均在80%以上，提示血清miRNA-126在今后的臨床應用中可能具有較多的價值。由于發生VM直接影響HCC患者的復發、轉移，因此本研究為miRNA-126成為HCC患者預后潛在標志物提供了研究基礎。

本研究也存在一定不足，首先研究納入的人群均為根治性HCC患者，肝癌巴塞羅那分期均為I-IIa期患者，缺少對于中晚期HCC患者發生VM的分析，這部分中晚期HCC患者腫瘤數目更多、體積相對更大，而這部分患者的miRNA-126與VM關系缺少分析。其次，本研究目前缺少對miRNA-126與患者長期隨訪的關系研究，尚不能判斷血清miRNA-126與患者復發、預后等方面的關系。今后將繼續對這些患者完成5年隨訪，探索術前血清miRNA-126與患者預后的關系。最后我們分析的相關因素較少，目前的研究僅能得出因果關系，更多的相關基礎研究值得今后繼續開展。

綜上所述，本研究發現了非編碼RNA miRNA-126與HCC血管生成擬態存在一定相關性?；颊咝g前血清miRNA-126低表達可一定程度上預測患者VM的發生。然而，miRNA-126和其他影響VM形成的因素，對HCC患者預后的判斷仍需要進一步研究。