TPM4在結直腸癌中的表達及其生物學意義

趙月鳴，韓秀娟，邢德君

(吉林省腫瘤醫院內三科，吉林 長春 130012)

每年全球有超過945 000的人們發展成為結直腸癌，其中大約492 000人死亡[1]。原發性結直腸癌多由遺傳性腫瘤綜合征或炎癥性腸病發展而來[2]。因此，結直腸癌的篩查和預防工程的普及就顯得尤為重要。當前已知在結直腸癌的發生發展過程中一些腫瘤相關的蛋白表達發生了明顯的改變，而且其致病的分子機制也已經被廣泛鑒別并加以闡明[3]。關于結直腸癌發病的分子機制方面的新進展終將對其靶向治療起到指導作用，因此進一步探討與結直腸癌的發生發展相關的基因學研究至關重要。TPM4是肌動蛋白結合蛋白中原肌球蛋白家族的一員，其表達水平的異常已經在幾種腫瘤中被發現，TPM4被認為是卵巢癌、乳腺癌、結腸癌、角化棘皮瘤與食管鱗狀細胞癌的潛在的檢測標志物[4]。本研究探討TPM4在結直腸癌中的表達及其生物學意義。

1 資料與方法

1.1研究對象:選擇2018年10月～2019年10月吉林省腫瘤醫院手術切除的結直腸癌組織及其癌旁組織，癌旁正常組織取材需位于癌組織上端，且距離腫瘤邊緣≥5 cm，經術后病理證實為陰性。結直腸癌標本經術后病理確診為腺癌，術前均未接受任何治療。30例結直腸癌患者男19例，女11例，年齡36～73歲，結腸癌22例，直腸癌8例，TNM分期Ⅰ期 3例，ⅡA 2例，ⅡB 5例，ⅡC 4例，ⅢA 2例，ⅢB 5例，ⅢC 4例，ⅣA 5例，分化程度低分化9例，中分化18例，高分化3例。腫瘤大小≥5 cm者8例，有淋巴結轉移16例，有遠處轉移者5例。

1.2蠟塊標本的制作過程:① 取材和固定:標本離體后先用生理鹽水沖洗，立即放入固定液(10%甲醛)中，使其蛋白質等成分迅速凝固，以保持組織原來的結構。②脫水:依次經70%、80%、90%、95%以及無水乙醇脫水，以去凈組織塊內的水分，最后完全由純酒精取代。③透明:將組織標本取出，放入二甲苯中，使酒精被二甲苯所置換。④浸蠟:將透明好的組織塊放入已熔化的石蠟內，使石蠟浸入組織，從而替換出二甲苯。⑤包埋:向包埋器內倒入熔化的石蠟，將浸蠟后的組織塊放入，待蠟液表面凝固后將其投入冷水中，使石蠟自然凝固。修整蠟塊，備用。

1.3免疫組化測定結直腸癌組織中TPM4表達:①蠟塊4 μm連續切片，貼于預先涂有多聚賴氨酸的載玻片上，60℃烘烤24 h備用。②切片經二甲苯脫蠟5 min×3，梯度酒精(100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%、85%各5 min)至水。③蒸餾水新鮮配制3%雙氧水，室溫孵育5～10 min，以滅活內源性過氧化物酶，蒸餾水洗3 min，共洗3次：④微波修復抗原:將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖溶液(pH值6.0)，放入微波爐在中高火條件下加熱5 min，然后冷卻10 min，再次在中高火條件下加熱3 min，最后自然冷卻至室溫。⑤0.01MPBS洗5 min，共洗3次。⑥滴加5%正常山羊血清封閉，置于保濕盒中 37℃，30 min,用濾紙將多余的液體吸干，不洗。⑦ 滴加TPM4一抗，4℃濕盒過夜，陰性對照滴加PBS液體，0.01MPBS洗5 min，共洗3次。⑧滴加TPM4 二抗，在37℃條件下放置30 min，用0.1MPBS洗3 min，共洗3次。⑨辣根酶標記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，置于保濕盒中 37℃，30 min，0.01MPBS洗3 min，共洗3次。⑩滴加新鮮配制DAB顯色劑，鏡下觀察，控制染色時間約5 min，且應用自來水充分沖洗切片至少10 min，終止顯色反應。蘇木素復染 1～5 min，蒸餾水充分洗滌，置于1%的鹽酸酒精中分化約20 s，蒸餾水充分洗滌去分化，放入1%的氨水中返藍約30 s，蒸餾水充分洗滌后乙醇逐級脫水(70%、80%、90%、100%Ⅰ、100%Ⅱ各2 min)，二甲苯透明(二甲苯5 min×3)，再用中性樹膠滴于切片上封片。

1.4免疫組化結果半定量判斷標準：①TPM4陽性表達主要位于細胞漿內，在顯微鏡下可見TPM4陽性反應物表現為棕黃色或者棕褐色顆粒；胞漿內未出現棕黃色或棕褐色顆粒的細胞則為TPM4表達陰性細胞。②評分標準：我們請兩位病理科專家在普通光學顯微鏡(200×視野)下進行雙盲閱片，每例隨機挑選5個視野，每個視野計數100個細胞。根據切片中陽性細胞所占比例和陽性細胞染色強弱判斷結果。① 陽性細胞所占比例計分：0分：陽性細胞比例<5%；1分：陽性細胞比例6%～25%；2分：陽性細胞比例26%～50%；3分：陽性細胞比例51%～75%；4分：陽性細胞比例>75%。② 陽性細胞顯色強度計分：0分：基本未著色；1分：細胞染色為淡棕黃色；2分：細胞染色為棕色；3分：細胞染色為深棕色。③ 將①和②兩項分值相乘，所得數值作為判斷標本陽性等級的標準。陰性(-)：0分，弱陽性(+)：1～4分，陽性(++)：5～8分，強陽性(+++)：9～12分。陽性表達率(%)=(弱陽+陽性+強陽)/總例數×100%。

1.5統計學方法：采用SPSS17.0軟件進行數據分析；樣本率比較采用四格表資料的確切概率法分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1TPM4在人結腸癌組織及癌旁組織中的表達：TPM4蛋白陽性反應物主要分布于結直腸癌及癌旁組織細胞胞質,但在癌組織中的表達明顯強于癌旁組織，見圖1。在結直腸癌組織中，TPM4陽性表達率為63.3%(19/30)；在癌旁組織中，TPM4的陽性表達率為23.3%(7/30)。結直腸癌組織與癌旁組織比較，TPM4的陽性表達率具有統計學差異(P<0.05)，見表1。

圖1 TPM4在結腸癌及癌旁組織中的表達及分布(DAB,×200)

表1 結直腸癌及癌旁組織中TPM4表達水平(例)

2.2結直腸癌組織TPM4陽性率與結直腸癌臨床病理學特征的關系：結直腸癌腫瘤TPM4蛋白表達的水平與腫瘤分化程度有關(P<0.05)，而與TNM分期、腫瘤大小、腫瘤位置、淋巴結轉移、遠處轉移、性別、年齡無關(P>0.05)。見表2。

表2 結直腸癌病人組織TPM4水平與臨床參數的關系(例)

3 討論

結直腸癌的發生機制尚未完全明確，早期診斷存在困難。目前，只要無手術禁忌證，治療結直腸癌首選治療方案為手術治療，根治術后病理結果決定術后是否行化療及放療[5]。術后出現局部復發及遠處轉移是導致結直腸癌患者死亡的重要原因[6]。如果能盡早發現轉移灶并及時給予相應治療，對延長生存期、提高生活質量的具有重要意義[7]。

TPM是以大量異構體形式廣泛分布于各種真核細胞中。它是細肌絲中與肌動蛋白的結合蛋白，是肌肉收縮過程中重要的調節蛋白質，在肌肉細胞調節收縮過程中鈣離子的敏感性[8]。在非肌肉細胞，原肌球蛋白不僅在收縮過程中起作用，而且在穩定細胞骨架肌動蛋白絲動力學、細胞分裂、胞質分裂和細胞內囊泡運輸等方面起到非常重要的作用[9]。研究表明，在一些腫瘤中TPM在調節細胞增殖和腫瘤生長調控中起著非常重要的作用[10]。Qi等人研究發現TPM4蛋白表達與食管鱗狀細胞癌的腫瘤分化程度相關[11]。Suehara等發現根據軟組織肉瘤組織學分類和分級的不同，幾個TPM的亞型表達也有差異[12]。研究發現TPM4在乳腺癌組織中呈高表達，但TPM4表達與腫瘤大小、年齡及腫瘤分期無相關性，但與乳腺腺組織SBR分級有關，也就是說SBR分級級別越高，惡性度越高，TPM4表達越強[13]。Kabbage等人經研究報道乳腺癌組織中TPM4陽性表達率達77.1%，但TPM4蛋白表達僅于乳腺癌分級有關，與腫瘤大小、年齡及腫瘤分期無相關性[14]。本試驗經免疫組化檢查發現TPM4陽性表達率僅66.3%，但低于Kabbage等中所提及TPM4蛋白陽性表達率[14]，考慮一方面是本實驗病人樣本量較小，另一方面考慮為結直腸癌組織中TPM4陽性表達率低，TPM4在癌組織中的表達可能有差異。

根據目前的調查，我們認為TPM4可能在結直腸癌腫瘤發生過程起到非常重要的作用。但TPM4如何促進結直腸癌發生、發展的分子機制仍不清楚。到現在為止，只有少數的研究試圖將TPM表達的變化與致癌信號傳導途徑聯系起來。作為一個例子，Zheng等人研究表明特定TPM的亞型在TGF-β介導的細胞運動控制方面起重要作用，在細胞獲得轉移能力方面也起到很重要的作用[15]。人乳腺上皮細胞中，表皮生長因子受體和TPM獲得性細胞骨架元素之間也建立聯系[16]。特殊的HMW TPM亞型在乳腺癌中引到腫瘤抑制劑的作用。Prasad等透露，在這種情況下，通過RNAi技術使HMW TPM1表達減少，對于增強細胞運動和增強腫瘤侵襲能力起到至關重要的作用[17]。有趣的是，一些研究揭露，當HMW TPM1消失時，癌細胞越來越依賴于LMW TPM4的表達[18-21]。在當今的研究中TPM4高效表達與其他文獻所表達的HMW TPMs下調有關[22]。

總之，本研究證實了TPM4在腫瘤組織中過表達。我們還發現TPM4表達與腫瘤的分期與分化程度相關，提示TPM4可能為結直腸癌的診斷和指導治療以及判斷預后提供了一個新的靶點。