齊墩果酸通過Wnt/β-catenin信號通路誘導骨肉瘤細胞凋亡的研究

王志國，饒艷偉

(1.赤峰市松山醫院骨科，內蒙古 赤峰 024005；2.吉林省人民醫院重癥醫學科，吉林 長春 130021)

骨肉瘤是一種常見的骨癌，有很高的侵襲能力和強的轉移能力，治療方法局限。手術治療是對骨肉瘤治療的主要方法，但還是很多轉移案例。化療是唯一有效控制骨相關轉移的治療手段。Wnt/β-catenin信號通路在多種癌癥的產生、進展和轉移中扮演一個重要的角色，包括骨肉瘤。Wnt/β-catenin信號通路的構成蛋白被用來作為骨肉瘤診斷的分子生物學標記。在很多研究中發現了抑制了Wnt/β-catenin信號通路可以抑制骨肉瘤的分化、成瘤和轉移能力，同時也發現異常的Wnt/β-catenin信號通路活化也可以導致一些表觀遺傳學的改變[1]。齊墩果酸是一種天然的五環三萜類化合物，可以從120種藥草和蔬菜中提取出來。研究認為齊墩果酸有很多種活性，主要為護肝作用，抗炎作用和抗腫瘤作用。隨著現代醫學研究的進展，發現齊墩果酸在腦膠質瘤、乳腺癌、骨肉瘤、肝癌和肺癌等腫瘤中有很好的抗癌作用[2-4]，其抗腫瘤活性的主要機制是細胞周期阻滯的誘導。但是齊墩果酸是否通過Wnt/β-catenin信號通路誘導骨肉瘤產生凋亡至今還沒有被闡述。

1 材料與方法

1.1藥品及主要試劑：齊墩果酸(美國 Sigma)，p-β-catenin蛋白抗體(美國 abcam)，Nuclear β-catenin蛋白抗體(美國 abcam)，3，3'-二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒。

1.2方法

1.2.1細胞培養和實驗分組：本次研究經過赤峰市松山醫院醫學倫理委員會同意。人骨肉瘤U2OS和KHOS細胞長春潤醫生物科技有限公司贈予。U2OS和KHOS細胞采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，置于37℃，5% CO2的恒溫二氧化碳細胞培養箱中培養，并保持一定的濕度。所有細胞均采用0.4%胰酶消化傳代培養。當細胞培養24 h后，給予更換含不同濃度的齊墩果酸培養液；實驗分組：Con組：10%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養。OA組：40 μmol/ml的OA處理骨肉瘤細胞作用36 h。

1.2.2MTT檢測U2OS和KHOS細胞增殖率：按使用說明書用MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]法檢測細胞生存能力。全自動酶標儀(波長570 nm)測定各孔OD值，計算細胞生存率。

1.2.3流式細胞術檢測Sub-G0/G1值：骨肉瘤細胞在加入不同濃度的OA后，36 h收集細胞，加入70%的乙醇，通過碘化丙啶(PI，200 mg/ml)固定，之后通過Aria Ⅱ sorter流式細胞儀分析(BD Biosciences)，每組計數10 000個細胞，統計出Sub-G0/G1值。

1.2.4Western Blot檢測U2OS和KHOS細胞中p-β-catenin和Nuclear β-catenin蛋白表達：提取細胞總蛋白，Bio-Rad法測定蛋白含量，然后按BCA蛋白定量試劑盒說明書步驟操作，測定樣品的蛋白濃度。用Image J圖像處理軟件計算各條豆類灰度值，分析p-β-catenin和Nuclear β-catenin蛋白表達情況。目的蛋白與內參照β-肌動蛋白(β-actin)的灰度值的比值進行描述表達情況。

1.2.5TOPFlash Reporter分析：β-catenin入核之后才能觸發了經典Wnt信號通路活化，β-catenin與轉錄因子TCF/LEF結合后，形成復合物之后才能引導調控下游基因的轉錄。因此，將數個拷貝的TCF/LEF的 DNA結合位點(AGATCAAAGGgggta，大寫堿基為DNA結合序列，小寫的堿基為間隔序列)克隆至含TA病毒最小啟動子(Minimal TA viral promoter)的螢火蟲熒光素酶報告系統載體中，構建得到TOP-Flash質粒(Millipore,MA)。本研究將TOP-Flash質粒與脂質體2000(Invitrogen)混合后，TOP-Flash質粒可隨著β-catenin的活性的改變，來影響了下游螢火蟲熒光素酶(pRL-TK)(40:1)(Promega,WI)的表達量。將上述混合物過夜，48 h候后，通過用細胞裂解液(Promega,WI)收集細胞，之后通過光度儀(Promega)測量熒光強度。取得通常以TOP/FOP的比值，即為Wnt信號通路活化的程度。

2 結果

2.1MTT檢測骨肉瘤細胞增殖率：隨著OA濃度增加和作用時間延長，骨肉瘤細胞的增殖率呈濃度和時間依賴性。在40 μmol/ml作用36 h U2OS細胞增殖率為(51±3.6)%，KHOS細胞增殖率為(57.66±2.52)%。提示40 μmol/ml作用36 h骨肉瘤細胞有顯著毒性作用，見圖1。

圖1 MTT檢測骨肉瘤U2OS和KHOS細胞增殖率

2.2流式細胞術檢測骨肉瘤U2OS和KHOS細胞的Sub-G0/G1比值：與對照組相比，骨肉瘤U2OS和KHOSOA組的Sub-G0/G1比值水平明顯增加，差異有統計學意義(P<0.001)。見圖2。

圖2 流式細胞術檢測骨肉瘤U2OS和KHOS細胞的Sub-G0/G1比值

2.3TOPFlash Reporter Assays檢測骨肉瘤細胞TCF/LEF的轉運活性：對照組相比，OA組TCF/LEF比值明顯降低，差異有統計學意義(P<0.001)，見圖3。

圖3 TOPFlash Reporter Assays檢測骨肉瘤細胞TCF/LEF的轉運活性

2.4Western Blot檢測骨肉瘤U2OS和KHOS細胞中p-β-catenin和Nuclear β-catenin的表達：與對照組相比，OA組p-β-catenin的表達水平增加(P<0.001)，而Nuclear β-catenin的表達水平降低(P<0.001)，見圖4。

圖4 Western Blot檢測骨肉瘤U2OS和KHOS細胞中p-β-catenin和Nuclear β-catenin的表達

3 討論

Wnt/β-catenin通路主要通過調節細胞質內的β-catenin蛋白進入細胞核內的水平發揮作用，細胞質內的β-catenin通過影響其末端的NH2降解結構域被磷酸化，通過β-TRCP1或者β-TRCP1的復合被多聚泛素化，之后通過泛素蛋白酶體介導的降解系統降解[5-6]。當Wnt受體出現時，與Wnt結合到受體復合物上，引起細胞內蛋白Dvl活化。活化Dvl引起GSK-3β被抑制，導致多蛋白復合物分解，β-catenin不能被泛素化降解，導致其發生堆積，之后被轉運入細胞核，與TCF/LEF結合，進而活化其下游的靶基因[7]。

本研究我們發現通過給予不同濃度的OA處理的骨肉瘤U2OS和KHOS細胞后，細胞增殖率隨著濃度增加和時間的延長，增殖率逐漸降低，這說明OA可以抑制骨肉瘤細胞的增殖率，隨后流式細胞術發現Sub-G0/G1比值水平也明顯增加，這說明了OA也能增加了U2OS和KHOS細胞的凋亡的發生。通過查閱文獻發現，OA可以抑制膀胱癌、肝癌和乳腺癌等癌癥細胞增殖和增加細胞凋亡[3,8-9]。為此研究進一步探討OA是誘導骨肉瘤細胞發生凋亡的，研究發現隨著OA濃度增加TCF/LEF的轉運活性水平明顯降低，同時p-β-catenin的表達隨著OA的濃度增加而增高，Nuclear β-catenin的表達隨著OA的濃度增加而降低。這說明了OA影響著骨肉瘤細胞漿中的p-β-catenin水平，進而降低細胞核中的β-catenin表達，引起下游基因TCF/LEF的轉運活性降低來影響細胞凋亡的發生。