GPR30受體拮抗對大豆異黃酮降低ox-LDL誘導的EA.hy926細胞氧化損傷的影響

郭金洲 陳海寧 馬晶鑫 田維毅 蔡 琨

貴州中醫藥大學,貴州 貴陽 550000

現代醫學認為動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是多因素共同作用引起的疾病，雖然其發病機制尚不明確。但研究發現，氧化應激是AS發生發展的重要因素[1]，而ROS蓄積增多引起的血管內皮氧化損傷是 AS發病機制的關鍵環節[2-3]。

G蛋白偶聯雌激素受體(G protein-coupled estrogen receptor,GPER/GPR30)作為一種新型的7次跨膜G蛋白偶聯雌激素膜受體[4]，在雌激素非基因組效應中發揮主要作用[5]。有報道稱，通過調節GPR30降低動脈粥樣硬化的發生[6]。以往的研究發現，大豆異黃酮(soy isoflavones,SIF)具有良好的抗氧化損傷作用[7-8]，SIF是植物雌激素的一種，具有類雌激素作用。因此我們推測大豆異黃酮可能通過GPR30介導的類雌激素效應降低內皮細胞氧化損傷。為驗證我們的猜想，實驗選用ox-LDL誘導EA.hy926細胞構建內皮氧化損傷模型，使用SIF干預損傷模型，觀察其抗氧化作用，并觀察使用GPR30受體拮抗劑G-15干預后，SIF抗氧化損傷效應的變化，進而探討SIF抗氧化損傷及其與GPR30的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人臍靜脈內皮細胞融合細胞(Human umbilical vein cell fusion cell，EA.hy926),購自中國科學院昆明細胞庫(編號：KCB2014049YJ)。

1.1.2 試劑與儀器 大豆異黃酮標準品購自上海源葉生物有限公司； ox-LDL購自廣州奕源有限公司；RIPA裂解液購自索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑購自尚寶生物科技有限公司；ET-1Elisa試劑盒購自深圳子科；LDH檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒均購自南京建成有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自BIO-RAD公司；RNA提取試劑盒購自Thermo公司；PrimeScriptTM RTreagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH PLUS)購自Takara公司；β-actin antibody、山羊抗兔熒光Ⅱ抗購自Absin公司；GPR30 antibody購自購自CST公司。CO2細胞培養箱、多功能酶標儀購自Therom公司；倒置顯微鏡購自OLYMPUS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞分組及處理 取對數生長期的EA.hy926細胞，隨機分為：空白對照組(Control)、模型組(ox-LDL)、雌二醇組(E2)、大豆異黃酮組(SIF)、GPR30受體拮抗劑組(G-15)。模型組加入終濃度40 mg·L-1ox-LDL ；雌二醇組、大豆異黃酮組在加入ox-LDL 的同時再分別給予終濃度為10 μmol·L-1E2和80 μg·L-1SIF，GPR30受體拮抗劑組預先使用10-7mol·L-1G-15干預2 h，然后加入終濃度40 mg·L-1ox-LDL和80 μg·L-1SIF，置于37 ℃、5%CO2條件下培養24 h。

1.2.2 CCK-8檢測細胞存活率 將細胞以5×103個/孔，接種于96孔板中，分組及處理方式參照2.1進行，干預結束后，吸棄細胞培養上清，每孔加入90 μL基礎培養基和10μL CCK-8試劑，孵育2 h，酶標儀450 nm波長測定各孔吸光值(OD)并計算細胞存活率，并按試劑說明書公式計算各組細胞存活率。

1.2.3 LDH、ET-1檢測 取對數生長期的EA.hy926細胞以1×106個/孔，接種于T25瓶中，按照2.1分組并處理細胞，吸取細胞培養上清，分裝于1.5 mLEP管中，于-20 ℃保存。細胞上清中LDH、ET-1檢測參照各自試劑盒說明書進行。

1.2.4 SOD、MDA的檢測 按照2.3收集細胞培養上清后，使用預冷的PBS沖洗細胞2次，加入適當預冷PBS于冰上使用細胞刮刀，收集細胞轉存于1.5 mLEP管中，1000×g，4 ℃離心5 min，棄上清后，加入含有1%蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，超聲粉碎后，于冰上裂解30 min，12000×g，4 ℃離心取上清，即得細胞蛋白，采用BCA法測定各組蛋白含量。SOD、MDA檢測參照各試劑盒說明書進行。

1.2.5 qRT-PCR檢測 HO-1 mRNA表達水平

按RNA提取試劑盒說明書進行RNA的提取，RNA樣品以OD260/OD280的比值在1.8～2.0之間為佳。RNA反轉錄按試劑盒進行，cDNA保存在-20 ℃。以cDNA作為模板進行PCR，反應體系及條件見表1。按2-ΔΔct法計算各基因相對表達水平。引物由上海生工生物工程有限公司設計合成，序列見表2。

表1 Real time PCR試劑配制

表2 引物序列

1.2.6 Western Blot檢測GPR30蛋白表達 細胞核蛋白提取按照核蛋白提取試劑盒說明書進行，細胞總蛋白提取及蛋白定量參照1.2.4進行，蛋白上樣量統一為30 μg，使用10%SDS-PAGE凝膠進行電泳，濕轉法于冰上轉膜1 h。5%脫脂奶粉封閉，分別加入一抗GPR30(1∶300)β-actin(1∶1000)，4℃孵育過夜。用TBST洗滌3次，加入二抗(1∶10000)室溫孵育1h,用TBST洗滌3次。采用ECL顯色，使用ImageJ軟件進行分析。

3 結果

3.1 不同處理方式對EA.hy926細胞存活率的影響 模型組細胞存活率較空白組顯著下降(P<0.01)；E2和SIF干預的細胞存活率較模型組顯著增高(P<0.01),拮抗GPR30受體后，SIF干預細胞存活率與模型組相比無差異，與E2和SIF干預組相比細胞存活率顯著下降。結果見表3。

表3 各藥物對EA.hy926細胞存活率的影響

3.2 不同處理方式對EA.hy926細胞培養上清中LDH、ET-1影響 與空白組相比，模型組、雌二醇組和大豆異黃酮組細胞上清中LDH活性、ET-1顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，雌二醇組和大豆異黃酮組，細胞上清中LDH活性、ET-1水平明顯降低均有顯著性差異(P<0.01);GPR30受體拮抗劑組與大豆異黃酮組相比，細胞上清中LDH活性、ET-1顯著升高(P<0.01)。結果如圖1所示。

注：A.各組LDH活性;B.各組ET-1水平；與正常組比較，**P<0.01;與模型組比較, ##P<0.01；與大豆異黃酮組比較,△△P<0.01。

3.3 不同處理方式對EA.hy926細胞中SOD、MDA影響 與空白組相比，模型組細胞SOD活力有顯著下降(P<0.01)MDA水平均顯著升高(P<0.01)，雌二醇組和大豆異黃酮組SOD活力、MDA水平亦無顯著性差異;與模型組相比，雌二醇組和大豆異黃酮組細胞SOD活力有顯著升高(P<0.01)MDA水平均顯著下降(P<0.01)；與雌二醇組組相比，大豆異黃酮組SOD活力及MDA水平無顯著性差異；GPR30受體拮抗劑組與大豆異黃酮組相比，細胞SOD活力顯著下降(P<0.01)MDA水平均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，SOD活力及MDA水平無顯著性差異。結果如圖2所示。

注：A 各組SOD活性；B各組MDA含量；與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較, ##P<0.01;與大豆異黃酮組比較,△△P<0.01。

3.4 各組細胞中HO-1 mRNA表達水平 與空白組相比，模型組、雌二醇組和大豆異黃酮HO-1 mRNA表達顯著升高(P<0.01);與模型組相比，雌二醇組和大豆異黃酮組HO-1 mRNA表達顯著升高(P<0.01)；與雌二醇組組相比，大豆異黃酮組HO-1 mRNA表達無顯著性差異；GPR30受體拮抗劑組與大豆異黃酮組相比，HO-1 mRNA表達顯著顯著下降(P<0.01)。結果見表4。

表4 各藥物對HO-1 mRNA表達的影響

3.5 各組細胞中GPR30受體蛋白表達情況 正常組細胞中，GPR30蛋白表達較低，在ox-LDL干預后，細胞內GPR30蛋白表達顯著增多，與正常組相比增多具有顯著性差異；ox-LDL分別與雌二醇和大豆異黃酮共同干預后，與正常組相比，GPR30蛋白表達顯著增多，與模型組相比，GPR30受體蛋白表達明顯降低；使用GPR30特異性阻斷劑G-15預先處理后，ox-LDL和大豆異黃酮共同干預，GPR30蛋白表達與正常組相比，無顯著差異，與大豆異黃酮組相比，顯著下降。結果如圖5所示。

注：與正常組比較，**P<0.01;與模型組比較, #P<0.05、##P<0.01；與大豆異黃酮組比較,△△P<0.01。

4 討論

ROS氧化修飾低密度脂蛋白(LDL)生成的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)[9]可導致內皮細胞中gp91吞噬細胞氧化酶表達增加，使NADPH氧化酶活性增強進而導致ROS生成增多[10]，引起血管內皮氧化損傷并進一步導致AS發生發展。在本次實驗中，使用ox-LDL干預EA.hy926細胞后，細胞生存率明顯下降，并出現了明顯的氧化損傷，證明模型制備成功。

女性絕經后，LDL-C水平急劇上升，而HDL-C水平則適度下降。同樣，HDL-C的下降伴隨著apoA-I水平的升高，進而導致動脈粥樣硬化和CAD發病率和死亡率升高，因此，有理由推測內源性腺激素起到了重要作用[11]。研究[12]發現，SIF可影響女性激素水平，其作為植物雌激素的一種，具有類雌激素作用，同時也是一種優良的天然抗氧化劑，對心血管疾病表現出良好的積極作用[13]。本次研究結果中，盡管SIF組中的LDH活性和ET-1水平相比正常組明顯升高，但相比于模型組細胞，SIF可以顯著提高其存活率，并且增加了抗氧化酶SOD的活性以及抗氧化化酶HO-1的mRNA表達水平，氧化損傷指標顯著降低。值得注意的是，實驗結果顯示，SIF降低氧化損傷的作用效果與雌二醇效果相當。使用雌二醇干預氧化損傷引起的動脈粥樣硬化在臨床應用中已早有報道，但有報道稱，長期暴露于大劑量雌二醇中會引起惡性癌癥[14]發生。同時有研究[15]表明，染料木素可降低由雌二醇引起的內皮損傷。SIF主要物質為染料木素、大豆黃素等，因此，筆者認為SIF在起到雌激素作用的同時，或許還可以降低雌激素過量引起的機體損傷。這為SIF在臨床中作為雌激素的替代品或作為應用雌激素時的輔助品提供了可能。

G蛋白偶聯雌激素受體GPR30在二十年前的人類乳腺癌細胞中發現，隨后在許多其他細胞中被發現。有報道稱，GPR30無處不在，具有多種生物學作用，包括調節內分泌，免疫，神經元和心血管功能[16]，以往的實驗[17]發現，GPR30可以減少絕經后的動脈粥樣硬化和炎癥的發生，揭示了GPR30的抗動脈粥樣硬化功能。有研究[18]表明，雌二醇可通過GPR30預防動脈粥樣硬化的發生。因此，筆者推測具有類雌激素作用的SIF或許可以作用于心血管系統中的GPR30受體降低內皮細胞氧化損傷，并進一步降低動脈粥樣硬化的發生。本實驗結果顯示，在使用GPR30受體特異性阻斷劑干預后，SIF降低內皮細胞氧化損傷的作用顯著降低，這也證實了筆者的推測。但有趣的是，在本次實驗結果中，正常組細胞GPR30蛋白表達很低，但在ox-LDL引起氧化損傷后，GPR30表達顯著升高，或許二者之間存在著某種特殊關系，本次實驗并未深入研究，這或將成為接下來的關注重點。但GPR30受體特異性阻斷后，與SIF組相比GPR30蛋白表達顯著降低，這至少證明了GPR30受體在SIF抗氧化損傷中起著重要作用。

綜上，筆者認為SIF對血管內皮細胞具有抗氧化損傷的作用，并可能是通過調節GPR30受體完成。不足之處，在于本研究僅僅通過體外實驗證明了GPR30拮抗在SIF降低氧化損傷的中作用，對其深層的作用機制未涉及，這將會是接下來的工作重點。