HPLC法測定藏藥三果湯中沒食子基兒茶素沒食子酸酯和表沒食子基兒茶素沒食子酸酯的含量

黃 寬 林艾和 范 源,2*

1.云南中醫藥大學，云南 昆明 650500；2.云南中醫藥大學第二附屬醫院，云南 昆明 650216

三果湯又名哲布湯，由訶子(Terminaliachebula)、毛訶子(Terminaliabellirica)和余甘子(Phyllanthusemblica)3味藥組成，為藏醫中重要的基礎方，《四部醫典》中記載，其具有治療瘟疫、紊亂熱癥、促使熱癥成型的作用[1]。現代研究表明，三果湯主要含鞣質酚酸類成分[2]，具有抗菌[3]、抗炎[4-5]、抗腫瘤[6-7]、抗氧化[8]、抗輻射[9]、降糖[10]、降脂[11]、肝腎損傷的保護[12-13]等藥理作用。沒食子基兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate，GCG)、表沒食子基兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)為兒茶素類物質，具有抗氧化、降脂、抗腫瘤、抗血栓等作用以及清除自由基活性等[14-18]。目前，尚無對三果湯中這兩個成分進行定量分析的報道，為更全面地評價三果湯的質量，本研究建立建立新的HPLC方法對三果湯中EGCG和GCG成分的含量進行定量測定。

1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，色譜柱為 Agilent Zorbax C18鍵合硅膠柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機(永康式速鋒工貿有限公司)；T-1000型電子天平(上海浦春計量儀器有限公司)；AB265-SMETTLER TOLEDO十萬分之一分析天平(Mettler-tolido international trade(Shanghai) co.LTD)。

表沒食子基兒茶素沒食子酸酯(EGCG批號：wkq20051208，四川省維克奇生物科技有限公司)、沒食子基兒茶素沒食子酸酯(GCG批號：wkq20051403，四川省維克奇生物科技有限公司)；訶子、毛訶子、余甘子(批號：20190803，安國市旭芳中藥材經營有限公司)。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Zorbax C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～8 min，8%～10% A；8 ～20 min，10%～15% A；20～50 min，15%～30% A；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。理論塔板數按EGCG計算應不低于5000，分離度均大于1.5。色譜圖如圖1所示。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取EGCG、GCG對照品2.31 mg、0.84 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇配制成EGCG、GCG濃度分別為0.2310 mg·mL-1和0.0840 mg·mL-1的混合對照品溶液。放置于4℃冰箱保存，臨用時放置至室溫。

2.2.2 供試品溶液 根據傳統藏醫藥中三果湯處方配比，訶子、毛訶子和余甘子3種藥材去核后按1∶1∶1的比例水煎制得[19]，稱取取訶子、毛訶子、余甘子藥材(去核)各1.0 g，搗碎，加入100 mL餾水，浸泡30 min，煎煮3次，每次20 min，過濾，合并3次濾液，濃縮定容至50 mL容量瓶中，冷藏備用。制備成含生藥0.5 g·mL-1的三果湯水提物，吸取備用三果水提物1 mL，加50%甲醇定容于10 mL容量瓶中，用0.45 μm的微孔濾膜進行過濾處理，即得到樣品溶液。

2.3 線性關系考察 分別精密稱取EGCG、GCG對照品11.55 mg、4.20 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇配制成EGCG、GCG濃度分別為0.2310 mg·mL-1和0.0840 mg·mL-1的混合對照品儲備液。精密吸取混合對照品儲備液各1、2、4、6、8、10 mL于10 mL量瓶中，分別加甲醇稀釋，得到EGCG分別為0.0231、0.0462、0.0924、0.1386、0.1848、0.2310 mg·mL-1；GCG分別為0.00840、0.0168、0.0336、0.0504、0.0672、0.084 mg·mL-1的6份不同質量濃度的混標溶液，精密吸取上述各溶液10 μL進樣。以質量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(X)，峰面積(mAU*s)為縱坐標(Y)進行線性回歸，繪制標準曲線進行回歸分析。EGCG回歸方程為Y=1391.4X-23.937，r=0.9996，表明EGCG在0.0231～0.2310 mg·mL-1范圍內EGCG的峰面積與質量濃度呈現良好的線性關系。GCG回歸方程為Y=3489.7X-59.47，r=0.9991，表明GCG在0.0084～0.0840 mg·mL-1范圍內GCG的峰面積與質量濃度呈現良好的線性關系。

表1 線性關系考察結果

2.4 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液，在“2.1”項條件下連續進樣6次，結果顯示EGCG、GCG峰面積RSD分別為0.53%、0.67%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，在“2.1”項條件下，分別于2、4、6、8、10、12 h進樣，結果顯示EGCG、GCG在10 h內峰面積的RSD值分別為0.91%、1.14%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.6 重復性試驗 取同一批訶子、毛訶子、余甘子藥材6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取6份供試品溶液各10 μL進樣，結果顯示EGCG、GCG平均含量為12.26 mg/g、5.23 mg/g， RSD分別為1.51%、1.47%，表明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗 精密稱取9份已知含量的訶子、毛訶子、余甘子藥材各0.5 g，按1∶1∶1配制成三果湯，分別按照藥材含有量的80%、100%、120%加入混合對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL在“2.1”項條件下進樣。結果見表2。其中，供試品溶液以10 μL進樣分析，測得EGCG和GCG均在標準曲線線性范圍內。

表2 加樣回收率試驗 (n=9)

續表2 表2 加樣回收率試驗 (n=9)

2.8 含量測定 取6份不同批次三果湯樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下條件下進樣，計算EGCG和GCG成分含有量，結果見表3。

表3 含量測定結果

3 討論

本試驗分別對不同流動相系統進行考察，乙腈(甲醇)-0.1%磷酸、乙腈(甲醇)-0.2%磷酸等流動相系統，結果表明，乙腈-0.1%磷酸水溶液作流動相進行梯度洗脫時，分離度較好且峰形尖銳。同時對柱溫(25、30、35℃)和流速(0.85、1.0、1.25、1.5 mL·min-1)進行了優化。結果顯示，柱溫25 ℃、流速 1.0 mL·min-1時分離效果好。本研究以EGCG和GCG作為三果湯水提物質量控制指標，建立了HPLC同時測定三果湯水提物中EGCG和GCG含量的方法。該方法簡便可行，結果準確，可有效控制三果湯水提物的質量，為藏藥三果湯的藥效物質基礎研究提供基礎。