漆姑草總黃酮大孔樹脂純化工藝研究

耿 亞 趙喜蘭 張 強

1.漯河醫學高等專科學校第二附屬醫院，河南 漯河 462300;2.漯河醫學高等專科學校，河南 漯河 462002

漆姑草(SpergulajaponicaSw．)為石竹科植物漆姑草的全草，分布于東北、華北、華東、中南、西南及陜西、廣西等地，具有涼血解毒、殺蟲止癢之功效[1]。文獻顯示[2]，漆姑草總黃酮對腫瘤具有一定的抑制作用，其中已分離得到的主要黃酮衍生物有：6，8-二-C-葡萄糖基芹菜素、6-C-阿拉伯糖基-8-C-葡萄糖基芹菜素、8-C-葡萄糖基芹菜菜、x″-O-鼠李糖基-6-C-葡萄糖基芹菜素[3]。目前，漆姑草總黃酮多采用溶劑提取法，但該法溶劑用量比較大，所得黃酮含量不高[4]，還需要進一步純化。大孔樹脂是一種重要的聚合物吸收劑，常用于自然資源中生物活性化合物的制備分離和純化。由于其高效，低污染和操作簡單的特點，大孔樹脂已被廣泛用于從天然植物中分離和純化活性成分，包括黃酮、生物堿、類萜和皂甙等[5]。本研究系統分析不同極性的大孔樹脂對漆姑草總黃酮的吸附和解吸能力，在最佳條件下，使用選定的樹脂純化漆姑草總黃酮。

1 材料與儀器

1.1 試驗藥物 漆姑草采集于貴陽花溪，經漯河醫學高等專科學校趙喜蘭副教授鑒定為石竹科植物漆姑草SpergulajaponicaSw．的全草；蘆丁對照品購自南京景竹生物科技有限公司(批號：20180211)。

1.2 主要試劑與儀器 D101、NKA-9、ADS-5、ADS-17、AB-8及ADS-F8大孔樹脂均購自天津南開和成科技有限公司；其余試劑均為分析純。R-220 旋轉蒸發儀購自上海亞榮生化儀器廠；雙光束紫外可見分光光度計購自上海譜元儀器有限公司。

2 方法與結果

2.1 含量的測定

2.1.1 對照品溶液的配制 精密稱取蘆丁對照品12.38 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇5 mL，超聲輔助溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度為0.495 mg/mL的蘆丁對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱定漆姑草(粉碎，過40目)1 g，加入75%甲醇50 mL，超聲輔助提取30 min，過濾，置于50 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 標準曲線的制備 精密吸取蘆丁對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，置10 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。分別吸取上述蘆丁溶液0.5 mL與2.5 mL蒸餾水混合，然后加入5%(m/v)的NaNO2溶液(150 μL)。 6 min后，加入250 μL10%(m/v)AlCl3·6H2O溶液，靜置5 min，加入1.0 mL 1.0 M NaOH。用蒸餾水將混合物調至5.0 mL，并充分混合。使用紫外可見分光光度計于510 nm處測量吸光度，以吸光度(Y)為縱坐標，蘆丁質量濃度(X)為為橫坐標，建立回歸方程，Y=9.847X-0.0059，r=0.9998。線性范圍為0.025～0.198 mg/mL。

2.1.4 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液，參照“2.1.3”分別于15、30、60、90、120 min測定吸光度，結果RSD為0.31%，表明樣品溶液在0～120 min呈色比較穩定。

2.1.5 重復性試驗 取同一批漆姑草6份，每份1g，參照“2.1.2” 項制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液，參照“2.1.3” 測定吸光度，結果漆姑草中總黃酮的平均含量為2.164 mg/g，RSD為0.48%，表明樣品溶液重復性較好。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，參照“2.3”連續6次測定吸光度值，結果RSD為0.47%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 加樣回收試驗 稱取已知含量的漆姑草(含量2.164 mg/g)粉末9份，每份0.5 g，分別按照已知含量的80%、100%、120%加入蘆丁對照品溶液(0.495 mg/mL)，參照“2.1.2”制備供試品溶液，測定吸光度，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收試驗 (n=6)

2.2 上樣品溶液的制備 將漆姑草自然風干至恒重，粉碎，過40目，稱取500 g，加20倍量的 80%乙醇浸泡1 h，然后加熱并在80 ℃回流提取3次，每次2 h。合并濾液，抽濾后用旋轉蒸發儀將濾液濃縮到原體積的1/6，超聲輔助溶解20 min，過濾，定容到100 mL作為樣品溶液，漆姑草總黃酮質量分數為10.82 mg/mL，冰箱保存備用。

2.3 樹脂的篩選

2.3.1 靜態吸附和解吸實驗 將3 g(M)樹脂放入250 mL錐形瓶中，加入100 mL(V) 濃度為1.082 mg/mL(C0，樣品溶液稀釋10倍)樣品溶液，25 ℃ 100 rpm振蕩吸附24 h，通過UV分析吸附后總黃酮的總濃度(C1)，每種樹脂的靜態吸附實驗重復3次。振蕩吸附24 h后，用100 mL蒸餾水洗滌樹脂，然后用100 mL 70%乙醇解吸。將裝有解吸溶液的錐形瓶在25 ℃ 100 rpm連續振蕩24 h，分析解吸溶液中總黃酮的濃度(C2)。每種樹脂的靜態解吸實驗重復3次。其中靜態吸附量Q(mg/g)=(C0-C1)×V/M，吸附率(%)=(C0-C1)/C0，靜態解析率(%)=(C2×V)×100%/(M×Q)。

表2顯示，所選的樹脂中，AB-8樹脂的吸附量明顯高于D101、NKA-9、ADS-5、ADS-F8，吸附率和解吸率明顯高于D101、NKA-9、ADS-5、ADS-17、ADS-F8樹脂(P<0.05)，因此，選擇AB-8樹脂作為漆姑草總黃酮純化的最佳樹脂。

表2 靜態吸附和解吸實驗結果 (n=3)

2.3.2 吸附動力學實驗 將3 g AB-8樹脂置入錐形燒瓶中，加入濃度為1.082 mg/mL樣品溶液100 mL，25 ℃ 100 rpm振蕩吸附，分別在30、60、90、120、180、240、300、360 min不同的時間間隔內，監測溶液中總黃酮的濃度，計算吸附率。

圖1顯示，AB-8樹脂在0～90 min內吸附率呈現明顯的增加趨勢，120 min時吸附率最高。然后，伴隨時間的推移，吸附率變化不大，故AB-8樹脂吸附時間選擇120 min。

2.3.3 解吸動力學實驗 將3 g AB-8樹脂置入錐形燒瓶中，加入濃度為1.082 mg/mL樣品溶液100 mL，25 ℃ 100 rpm振蕩吸附120 min，100 mL蒸餾水洗滌， 100 mL(V) 70%乙醇解吸，分別在30、60、90、120、180、240、300 min不同的時間間隔內，監測解吸液中總黃酮的濃度，計算解吸率。

圖2顯示，0～120 min黃酮的解吸率呈現明顯的增加趨勢，120 min解吸率達到最高。然后伴隨時間的推移，解吸率無明顯的變化。故黃酮解吸時間選擇120 min。

2.4 純化漆姑草總黃酮工藝

2.4.1 樣品溶液濃度對吸附率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將濃度分別為8.608、4.304、2.152、1.076、0.586、0.293 mg/mL漆姑草總黃酮樣品液70 mL上樣至預處理的層析柱(2.6 cm × 40 cm)頂部，室溫(25 ℃)下保持40 min，以達到黃酮充分吸附。吸附后，用2 BV蒸餾水以2 BV/h體積流量淋洗AB-8樹脂，收集洗脫液，測定洗脫液中總黃酮的濃度，計算吸附率。

圖3顯示，總黃酮濃度在0.293～1.076 mg/mL時，吸附率較好，并呈現明顯的上升的趨勢。而總黃酮濃度在1.076～8.608 mg/mL時，吸附率呈現明顯的下降趨勢。可能是黃酮濃度較低時，便于樹脂吸附，而高濃度的黃酮易堵塞樹脂微孔，吸附率下降。故上樣液濃度選擇1.076 mg/mL。

2.4.2 樣品溶液體積對吸附率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將濃度為1.076 mg/mL漆姑草總黃酮樣品液上樣至層析柱(2.6 cm × 40 cm)，上樣體積流量為2 BV/h，收集流出液，每管10 mL，檢測總黃酮濃度，繪制吸附泄露曲線。

圖4顯示，上樣體積1～6 BV時，泄漏液中總黃酮濃度較低，且變化不大，而7 BV時，AB-8樹脂基本達到飽和狀態，泄漏明顯。故上樣液體積選擇6 BV。

2.4.3 pH對吸附率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將70 mL pH分別為3、4、5.7、6、7、8的樣液(總黃酮質量濃度1.076 mg/mL)上樣至層析柱(2.6 cm × 40 cm)，上樣體積流量為2 BV/h，并在室溫(25 ℃)下保持40 min，以達到黃酮充分吸附。用2 BV蒸餾水以2 BV/h體積流量淋洗AB-8樹脂，收集洗脫液，測定洗脫液中總黃酮的濃度，計算吸附率。

圖5顯示，pH從3～5.7，總黃酮的解吸率呈現明顯的上升趨勢，然后伴隨pH的增加，解吸率呈現明顯的下降趨勢。其原因可能是酸性過大，容易形成烊鹽，而pH過大會破壞黃酮的化學結構。故pH選擇5.7，即原液的pH。

2.4.4 乙醇體積分數對解吸率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將70 mL的樣液(總黃酮質量濃度1.076 mg/mL)上樣至預處理的層析柱(2.6 cm × 40 cm)，上樣體積流量為2 BV/h，流出液重復上樣一次，2 BV蒸餾水沖洗，3 BV不同濃度的乙醇(30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%)以2 BV/h體積流量進行解吸，收集洗脫液，測定洗脫液中總黃酮的濃度，計算解吸率。

圖6顯示，伴隨乙醇體積分數的增加，解吸率呈現明顯的增加趨勢，當體積分數達到70%時，解吸率最佳，故乙醇體積分數選擇70%。

2.4.5 洗脫液體積對解吸率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將70 mL的樣液(總黃酮質量濃度1.076 mg/mL)上樣至預處理的層析柱(2.6 cm × 40 cm)，上樣體積流量為2 BV/h，流出液重復上樣一次，2 BV蒸餾水沖洗，然后采用1、2、3、4、5 BV體積分數70%的乙醇以2 BV/h體積流量進行解吸，收集洗脫液，測定洗脫液中總黃酮的濃度，計算解吸率。

圖7顯示，伴隨洗脫體積的增加，解吸率呈現明顯的增加趨勢，當洗脫體積達到3 BV時，解吸率最佳，繼續增加洗脫體積，解吸率變化不大。故洗脫體積選擇3 BV。

2.4.6 洗脫流速對解吸率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將70 mL的樣液(總黃酮質量濃度1.076 mg/mL)上樣至預處理的層析柱(2.6 cm × 40 cm)，上樣體積流量為2 BV/h，流出液重復上樣一次，2 BV蒸餾水沖洗，然后采用70%的乙醇分別以1、2、3、4 BV/h體積流量進行解吸，收集洗脫液，測定洗脫液中總黃酮的濃度，計算解吸率。

圖8顯示，流速為1～2 BV/h時，解吸率較高。伴隨流速的增加，解吸率呈現明顯的下降趨勢。但流速過低，洗脫時間將明顯延長，故流速選擇2 BV/h。

2.5 驗證實驗 選擇三份樣品，每份500 g，在最佳純化工藝條件下，分別進行吸附-解吸實驗，計算純化后漆姑草總黃酮的質量分數，結果平均總黃酮質量分數為75.50%，RSD 為 1.21%，表明本研究所建立的 AB-8 樹脂純化漆姑草總黃酮的方法穩定、可靠。見表2。

表2 中試試驗

3 討論

紫外分光光度法是測定總黃酮含量比較常用的方法，具有操作簡便、高效、快速的特點，已被廣泛應用于黃酮的定量分析。本研究中，通過方法學考察發現，該法穩定性較好，溶液在0～120 min呈色比較穩定。實驗的可重復性和儀器精密度良好，加樣回收率達到95.48%～101.25%，可作為測定漆姑草總黃酮的有效方法。

目前，黃酮類化合物的純化主要應用大孔吸附樹脂和聚酰胺樹脂。與聚酰胺樹脂相比，大孔吸附樹脂具有吸附容量大、選擇性好、再生簡便、價格低廉等優點，在黃酮類化合物的分離純化中得到廣泛應用[6]。本研究選擇非極性(D101、ADS-5型)、弱極性(AB-8、ADS-17型)以及極性(NKA-9、ADS-F8型)大孔樹脂，系統地研究和比較6種樹脂的吸附和解吸能力，初步考察不同類型樹脂對草果總黃酮的富集效果。結果顯示，AB-8樹脂因其出色的吸附和解吸能力而被選擇為最佳吸附劑，與漆姑草總黃酮極性特征對應。本研究在預試驗基礎上，對上樣液濃度、上樣液體積、上樣液pH、洗脫液乙醇體積分數、洗脫液體積、洗脫流速進行了單因素試驗，結果漆姑草總黃酮純化的最佳工藝條件為：進料溶液在pH值為5.7、上樣液體積6 BV，在25 ℃原始總黃酮濃度為1.076 mg/mL的條件下進行。靜態洗脫和動態洗脫溶液選擇為體積分數為70%的乙醇、洗脫液體積3 BV、洗脫流速2 BV/h以提高漆姑草總黃酮的解吸率。通過AB-8樹脂進行動態吸附和解吸后，最終產品中總黃酮質量分數為75.50%。

總之，本研究以漆姑草總黃酮含量為指標，以分光光度法作為定量分析手段，利用AB-8樹脂開發了一種從漆姑草中分離純化黃酮類化合物的可行而有效的方法。