犬瘟熱病毒(CDV) RPA-SYBR GreenⅠ 檢測方法的建立與應用

郝 鐲，張珊珊，李 楠，田 多，李吉平，孟軻音，萬忠海，穆玉堂，李忠義，王承宇

(軍事科學院 軍事醫學研究院 軍事獸醫研究所/吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，吉林 長春 130122)

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒(CDV)引起的一種高度傳染性傳染病，在犬及野生肉食動物中廣泛傳播，是危害犬及毛皮經濟動物的主要疫病之一，給寵物業和毛皮動物產業帶來嚴重的經濟影響[1]。目前對CDV的檢測方法主要有ELISA、半定量PCR、LAMP等[2]，這些方法靈敏度高，特異性好，但是反應時間長，對實驗操作人員的技術水平和儀器精密度要求高，不適于獸醫臨床或野外現場檢測。膠體金檢測試紙條的方法雖然簡便快速，但靈敏性較低，且容易出現假陽性，因此不適合患病動物的早期診斷。

重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)是一種恒溫核酸擴增技術，按照RPA反應要求設計上下游引物，根據不同的RPA產物檢測方法設計不同的檢測探針。RPA反應包含3種核心酶即重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換多聚異構酶，它們協調引物配對靶向RNA/DNA合成DNA，短時間內將核酸模板從痕量水平擴增到可檢測水平，具有高敏感性和特異性[3]，非常適于獸醫臨床的早期診斷。SYBR Green Ⅰ是一種可結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料。在游離狀態下，SYBR Green Ⅰ發出微弱的熒光，一旦與雙鏈DNA結合聚集后，熒光大大增強。由于RPA引物標記FAM基團，因此擴增的靶標產物與SYBR Green Ⅰ結合后可產生熒光綠色沉淀復合物，非靶標產物與SYBR Green Ⅰ結合后只顯現核酸染料的原始顏色，即為紅褐色，RPA擴增產物與SYBR Green Ⅰ結合使結果可通過肉眼觀察，所以適用于臨床及野外檢測[1]。……