TOPK抑制劑HI-TOPK-032對胰腺神經內分泌腫瘤BON-1細胞體外惡性表型的影響

郭鑫，李剛，葉辰，阿卜杜·海拜爾·薩杜拉，任思謙，袁蒙，孟猛，錢海利，原春輝

（1.北京大學第三醫院 普通外科，北京 100191；2.國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院 分子腫瘤學國家重點實驗室，北京 100027）

胰腺神經內分泌腫瘤（pancreatic neuroendocrine tumors，pNETs）是一類起源于胰腺神經內分泌細胞的罕見腫瘤。隨著診斷水平的提高和對該疾病認識的加深，pNETs發病率和檢出率正逐年上升。根據臨床表現，pNETs可分為功能性和無功能性，pNETs確切的病因和發病機制目前尚不明確。由于pNETs早期無明顯癥狀，大多數患者確診時已經遠處轉移，這嚴重影響患者預后[1]。尋找新的有效治療方法，對于pNETs的治療和預后至關重要。

TOPK（T-LAK cell-originated protein kinase），也被稱作PBK（PDZ-binding-kinase），是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶[2-3]，TOPK屬于MAPK激酶家族成員，與細胞有絲分裂紡錘體的形成相關，TOPK在染色體的正確分離和細胞分裂中發揮重要作用[4]。TOPK主要表達于高增殖水平的組織，在成年人正常組織中，睪丸組織的表達最高[2]。TOPK在結腸癌[5]、食管癌[6]、淋巴瘤[7]、肺癌[8]等多種腫瘤中高表達。研究表明，TOPK可以調控腫瘤細胞周期，影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移[9]，并與多種腫瘤的不良預后相關[10]。在胰腺癌中，TOPK高表達與胰腺癌細胞侵襲性密切相關，TOPK通過調節基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-9 和基因啟動子活性直接調節胰腺癌細胞的侵襲能力[11]。因此，使用TOPK靶向抑制劑可能成為治療胰腺腫瘤的一個新方法。HITOPK-032是由Kim等[5]利用體外激酶檢測篩選并鑒定出的新型TOPK抑制劑，HI-TOPK-032能強烈抑制TOPK活性，抑制結腸癌異種移植腫瘤模型的生長。基于TOPK在腫瘤發生發展中的重要作用，本研究旨在探討使用TOPK抑制劑HI-TOPK-032 對胰腺神經內分泌腫瘤BON-1細胞體外表型的影響，期望能以TOPK為突破口為pNETs的治療尋找新藥物。

1 材料和方法

1.1 細胞培養和試劑

胰腺神經內分泌腫瘤BON-1、QGP-1細胞購自于北京北納生物技術有限公司。HPDE、Mia-2、SW-1990 細胞系均為本實驗室自存細胞，細胞培養基為10%胎牛血清的RMPI-1640培養基，培養條件為37 ℃、5% CO2培養箱；6孔板、96孔板、培養皿購自于Corning公司；HI-TOPK-032購自于MCE公司，用DMSO溶解后儲存在-80 ℃冰箱凍存備用；TOPK抗體購自于proteintech公司，Tubulin抗體購自于CST公司，PI母液購自于北京普益華科技有限公司，Annexin V試劑購自于賽默飛公司。

1.2 TOPK蛋白表達水平檢測

采用Western blotting法。待檢測細胞PBS清洗后，加入細胞裂解液在冰上裂解30 min，每10 min振蕩一次，將細胞裂解液4 ℃、12 000 r/min離心15 min。測濃度，加入5×緩沖液煮樣10 min。計算蛋白上樣量后在10% PAGE膠上電泳分離，然后轉膜至PVDF膜。轉膜完畢后，將膜放置于4 ℃含有50 g/L脫脂奶粉的TBST中封閉1 h，一抗4 ℃過夜孵育。TBST清洗3遍，每次5 min，室溫孵育二抗1 h，清洗后化學發光液進行曝光。

1.3 細胞增殖檢測

采用CCK-8 法。取生長狀態良好的待檢測細胞，PBS清洗，胰酶消化，使用完全培養基終止并計數；調整細胞懸液至合適濃度，在96 孔板中每個孔種2×103個細胞，培養基體積定容至100 μL，每種細胞重復3次，置于37 ℃、5% CO2條件下培養，分別培養24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，溫箱內孵育2 h；酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.4 細胞克隆形成檢測

平板克隆形成實驗法。取生長狀態良好的待檢測細胞，PBS清洗，胰酶消化，使用完全培養基終止消化后計數；調整細胞懸至合適濃度，每個中皿種2×103個細胞，每種細胞重復3次，充分搖晃均勻后置于37 ℃、5% CO2條件下培養兩周左右；每隔4 d更換一次培養基，待每個細胞單克隆長到大于50個細胞時，終止培養；棄去培養基，PBS清洗，甲醇固定，0.5%的結晶紫染色，流水沖洗干凈，室溫晾干后拍照計數。

1.5 細胞遷移和侵襲檢測

Transwell法。遷移實驗時，取生長狀態良好的待檢測細胞，胰酶消化，PBS清洗，使用完全培養基終止消化后計數；用不同濃度HI-TOPK-032的無血清RMPI-1640 培養基調整細胞懸液至合適濃度，取1.5×105個BON-1細胞接種于上室，體積200 μL，下室加入600 μL含20%血清的RMPI-1640 完全培養基和相應濃度藥物，待適當數量的細胞穿過小室后，終止實驗，甲醇固定，0.5%結晶紫染色，自來水沖洗，擦去未穿過小室的細胞，室溫晾干后拍照、計數，每組實驗設置3 個重復。侵襲實驗，將融化后的Matrigel膠稀釋到終濃度為50 mg/L（1:40稀釋液）；吸取100 μL 1:40稀釋后的Matrigel膠溶液加入到Transwell小室，37 ℃、5% CO2培養箱中靜置1 h，其他方法同遷移實驗。

1.6 細胞周期檢測

將適量的BON-1 細胞種于6 孔板中，培養基分別為含0、1、2.5、5 μmol/L HI-TOPK-032的RMPI-1640完全培養基，37 ℃、5% CO2培養箱中培養72 h，胰酶消化，PBS清洗離心，75%乙醇，-20 ℃過夜固定；預先配制PI工作液，1 000 r/min，5 min離心細胞懸液，棄去上清，加入400 μL PI工作液，冰上避光孵育15 min，流式細胞儀檢測。

1.7 BON-1細胞凋亡和壞死檢測

將BON-1細胞種于6孔板中，培養基分別為含0、1、2.5、5 μmol/L HI-TOPK-032的RMPI-1640完全培養基，37 ℃、5% CO2培養箱中培養72 h；離心收集培養基中的細胞碎片，PBS清洗并離心收集細胞碎片，胰酶消化，PBS清洗，離心；細胞中加入100 μL的1×Binding buffer，加入5 μL的Annexin V和PI工作液室溫條件下避光染色15 min；加入400 μL的1×Binding buffer，1 h內進行流式檢測。

1.8 統計學分析

使用Image J軟件計算Western blotting蛋白條帶的灰度值并計算蛋白相對表達量。使用SPSS 22.0進行統計數據，采用ANOVA方差分析比較對照組與實驗組間結果差異，組間比較采用LSD-t多重檢驗，所有數據采用（）表示。使用Graphpad Prism軟件7.0版制作圖片。P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TOPK在多種胰腺腫瘤中高表達

我們通過Western blotting實驗檢測正常胰腺導管上皮細胞（HPDE）與胰腺導管腺癌細胞系Mia-2、SW-1990和胰腺神經內分泌腫瘤細胞系BON-1、QGP-1 中TOPK的表達水平。結果顯示，與HPDE相比，TOPK蛋白表達水平在胰腺導管腺癌細胞系Mia-2、人胰腺癌細胞系SW-1990細胞系和胰腺神經內分泌腫瘤細胞系BON-1中表達顯著上調（TOPK蛋白相對表達量比值分別為1.0:2.6:1.7:2.3:1.0），如圖1所示。

圖1 TOPK蛋白在正常胰腺導管上皮細胞（HPED）、胰腺導管腺癌細胞（Mia-2、SW-1990）和胰腺神經內分泌腫瘤細胞（BON-1、QGP-1）中的表達情況

2.2 HI-TOPK-032顯著抑制BON-1細胞增殖

我們通過CCK-8 實驗檢測在含0、1、2.5、5 μmol/L濃度的HI-TOPK-032培養基中BON-1細胞在24、48和72 h生長情況觀察細胞的增殖情況。結果顯示，與對照組相比，在72 h時，實驗組BON-1細胞體外增殖被顯著抑制，增殖隨濃度增加依次降低（22.2±8.2）%、（90.4±1.0）%、（89.7±0.9）%（P＜0.001），如圖2A所示。

2.3 HI-TOPK-032顯著抑制BON-1細胞克隆形成

分別使用0、1、2.5、5 μmol/L 濃度的HITOPK-032培養基培養BON-1細胞系，計算克隆形成數目，檢測其對BON-1細胞克隆形成的作用。結果顯示，與對照組相比，HI-TOPK-032處理BON-1細胞后，克隆形成能力被顯著抑制，克隆隨濃度增加依次減少（19.1±2.1）%、（42.5±5.7）%、（87.0±5.6）%（P＜0.001），如圖2B、2C所示。

圖2 HI-TOPK-032抑制BON-1細胞增殖和克隆形成

2.4 HI-TOPK-032顯著抑制BON-1細胞的遷移和侵襲能力

我們通過Transwell實驗檢測0、1、2.5、5 μmol/L濃度的HI-TOPK-032培養基對BON-1細胞的遷移和侵襲能力抑制效果。結果表明，HI-TOPK-032可有效地抑制BON-1細胞的體外遷移、侵襲能力，與對照組相比，BON-1細胞遷移能力隨濃度增加依次減弱（9.3±5.6）%、（70.5±4.0）%、（87.5± 3.5）%（P＜0.01），侵襲能力隨濃度增加依次減弱（23.0±4.2）%、（60.7±5.4）%、（93.6±3.0）%（P＜0.01），如圖3所示。

圖3 HI-TOPK-032顯著抑制BON-1細胞遷移和侵襲形成

2.5 HI-TOPK-032影響BON-1細胞的細胞周期

分別使用0、1、2.5、5 μmol/L 濃度的HITOPK-032培養基培養BON-1細胞系72 h，使用流式檢測細胞周期，結果顯示，與對照組相比，使用2.5、5 μmol/L濃度HI-TOPK-032后，G0/G1期的細胞比例依次增加（12.2±2.0）%、（18.3±1.4）%（P＜0.001），在5 μmol/L濃度時，S期的細胞比例減少（18.4±6.1）%（P＜0.01），在2.5、5 μmol/L濃度時，G2/M期的細胞比例依次減少（17.6±8.6）%、（16.4±4.5）%（P＜0.001），這提示2.5 μmol/L濃度以上時，HI-TOPK-032可以調控BON-1細胞周期進程，如圖4所示。

圖4 HI-TOPK-032調控BON-1細胞周期

2.6 HI-TOPK-032顯著促進BON-1細胞壞死和凋亡

分別使用0、1、2.5、5 μmol/L 濃度的HITOPK-032 培養基培養BON-1 細胞系72 h，使用Annexin V染色，流式檢測凋亡。結果顯示，HITOPK-032 顯著促進BON-1 細胞壞死和凋亡，凋亡隨濃度增加依次增加（60.6±30.9）%（P＜0.05）、（79.5±27.5）%（P＜0.01）、（165.8±34.9）%（P＜0.001），5 μmol/L濃度時，壞死顯著增加，增加（385.8±67.3）%（P＜0.001），如圖5所示。

圖5 HI-TOPK-032促進BON-1細胞凋亡和壞死

3 討論

TOPK通過持續維持致癌底物的磷酸化，使癌細胞克服細胞死亡信號通路，繞過調控檢查點控制，從而促進腫瘤的生長和進展，抑制TOPK是克服腫瘤侵襲性、轉移性生長和治療耐藥性的一種重要的治療策略[9，12]。

HI-TOPK-032作為一種TOPK特異性抑制劑，在多種腫瘤中顯示出良好的抑制腫瘤的效果[13-19]。HITOPK-032 通過抑制ERK磷酸化從而抑制結腸癌腫瘤細胞增殖[5]，通過抑制c-Jun磷酸化從而抑制皮膚癌細胞增殖和克隆形成[12]，可以抑制鼻咽癌、膠質瘤異種移植瘤的生長[14-15]。HI-TOPK-032 可以阻滯淋巴瘤細胞周期，誘導腫瘤細胞發生凋亡[16]。

在本研究中，使用不同濃度的HI-TOPK-032均可以抑制胰腺神經內分泌腫瘤BON-1細胞的體外增殖和克隆形成，且抑制效果呈劑量依賴式。TOPK在有絲分裂過程中起到重要作用，TOPK能強烈促進了細胞分裂[4，17]。本研究中，使用HI-TOPK-032可以特異性抑制BON-1 細胞中TOPK活性，從而抑制BON-1細胞分裂，使BON-1細胞的增殖和克隆形成能力減弱。本研究結果表明，使用HI-TOPK-032可以顯著抑制BON-1細胞的遷移和侵襲能力，這提示HI-TOPK-032具有防止腫瘤轉移的潛力。腫瘤細胞最顯著的特征之一是細胞周期異常，探索調控腫瘤細胞周期的方法成為腫瘤治療的重要方法[18]。本研究核心之處是通過流式檢測了使用不同濃度HITOPK-032 對BON-1 細胞周期和凋亡壞死的影響，結果表明，在HI-TOPK-032濃度大于2.5 μmol/L后，G0/G1期的細胞比例增加，S期和G2/M期細胞比例減少，證明了較高濃度的HI-TOPK-032能夠提供調控BON-1細胞周期，將BON-1細胞的分裂阻滯在G0/G1期。同時，使用HI-TOPK-032 抑制TOPK活性導致BON-1細胞凋亡和壞死顯著增加，在5 μmol/L濃度時，促進BON-1細胞凋亡和壞死的效果均最顯著。

HI-TOPK-032在多種腫瘤中以劑量依賴的方式抑制腫瘤的增殖和活力[5，19]。在本研究表明，HITOPK-032 濃度在1～5 μmol/L時，在胰腺神經內分泌腫瘤BON-1 細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲等體外惡性表型被顯著抑制。較高濃度的HITOPK-032可以調控細胞周期，促進凋亡和壞死。

本研究首次表明，HI-TOPK-032能調控胰腺神經內分泌腫瘤BON-1 細胞周期，促進腫瘤凋亡壞死，顯著抑制BON-1細胞體外惡性表型，證明了HITOPK-032 作為TOPK靶向抑制劑在胰腺神經內分泌腫瘤中的應用價值，同時也為胰腺神經內分泌腫瘤動物體內移植瘤模型的藥理實驗研究提供重要依據。

本研究不足之處，一是未闡明HI-TOPK-032在BON-1細胞中發揮抑制惡性表型作用的分子生物學機制；二是未開展動物體內實驗驗證其抑制效果和量效關系。

4 結論

本研究表明，在體外試驗中，HI-TOPK-032 顯著抑制胰腺神經內分泌腫瘤BON-1 細胞系的惡性表型的效果，有效抑制了BON-1 細胞的增殖、克隆形成、侵襲和遷移，調控BON-1 細胞周期，促進BON-1細胞的凋亡和壞死。目前針對HI-TOPK-032的藥物策略的開發仍處于臨床前階段。預期在未來，在pNETs患者中，經免疫組化檢查，對TOPK陽性表達的患者使用TOPK抑制劑可能有效抑制腫瘤的生長，提高患者生存率，改善不良預后。