來那度胺通過抑制VEGF蛋白表達抑制人肝癌細胞LM3的遷移和侵襲

來佳程，鄭亦胡，唐銀河

（1.溫州醫科大學，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 肝膽外科，浙江 溫州 325000）

肝癌是常見的消化道腫瘤，GLOBOCAN數據庫的最新統計結果顯示，2018 年全球診斷出約84.1萬肝癌新病例，并有78.1 萬人死于肝癌。肝癌在全球腫瘤中排名第5[1]，在中國惡性腫瘤發病率中排名第4，是中國癌癥死亡的第二大原因[2]。雖然肝癌的治療方式在進步，但由于早期診斷的缺乏及其高轉移率和復發率，肝癌的長期預后仍然較差，在中國5年生存率僅14.1%[3]。因此需要進一步研究肝癌轉移和侵襲的分子機制，找到新的藥物和靶點進行干預。以往的研究發現，血管內皮生長因子/血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor/vascular endothelial growth factor receptor，VEGF/VEGFR）在腫瘤中往往呈現高表達，VEGF刺激血管內皮細胞生長，形成微血管，對腫瘤進行營養物質供給[4]。在胰腺癌中，VEGF與VEGFR結合后可以激活上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促進腫瘤細胞的侵襲[5]。在腸癌細胞發生EMT時，VEGF和VEGFR-1的表達均增加，并通過自分泌途徑促進細胞生長，以避免細胞因缺少黏附而凋亡[6]。來那度胺是一種免疫調節藥物，并具有良好的抑制血管生成作用，廣泛用于各種血液系統疾病。來那度胺具有抑制VEGF表達的效果，被發現可以抑制小鼠腸癌細胞遷移和侵襲[7]并能促進結直腸癌血管正常化，增強化療效果[8]。本實驗旨在研究來那度胺對肝癌細胞LM3遷移和侵襲的影響并探究其潛在機制。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

人肝癌細胞LM3 細胞系（中科院上海細胞庫），胎牛血清（美國，Sigma Chemical），E-cadherin、Vimentin、Snail蛋白抗體（美國，Cell Signaling Technology），VEGF蛋白抗體（美國，Affinity Biosciences），GAPDH抗體（美國，Affinity Biosciences），DMEM細胞培養液和胰蛋白酶（美國，Gibco），蛋白酶抑制劑、RIPA緩沖液（中國北京，Solarbio），羊抗兔二抗（美國，Cell Signaling Technology），Transwell小室（美國，Costar），基質膠（美國，Corning）。

1.2 細胞培養

將人肝癌細胞LM3 培養于含10%胎牛血清，l00 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基。培養環境為37 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養箱。根據細胞生長情況決定傳代時間，用0.25%EDTA胰酶進行消化傳代，選擇對數生長期的細胞作為實驗對象。

1.3 細胞活性測定

細胞增殖實驗：將對數期生長的LM3細胞按照8×103個/孔的密度接種到96孔板中，24 h后待腫瘤細胞貼壁，棄去孔內培養液，加入分別含有5、10、20、40、80 μmol/L來那度胺培養基100 μL，以不含來那度胺的培養基100 μL作為對照，每組設置6 個復孔。繼續培養24 h、48 h后，分別每孔加入10 μL的CCK-8 試劑，在培養箱內孵育2 h，檢測450 nm波長處的吸光度（記為A值），則細胞存活率=[（實驗組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）]×100%。

1.4 細胞遷移和侵襲測定

NC組（對照組），Lena組（40 μmol/L來那度胺處理48 h），VEGF組（人重組VEGF 10 ng/mL處理48 h）和VEGF+Lena組（人重組VEGF 10 ng/mL預處理48 h后再用40 μmol/L來那度胺處理48 h）。

劃痕實驗：分別取普通LM3 細胞及VEGF預處理的細胞5×105個植入6 孔板中，確保貼壁后融合率達到90%～100%。貼壁后用200 μL槍頭進行劃痕之后，分別加入3 mL普通培養基，40 μmol/L來那度胺，10 ng/mL VEGF。VEGF預處理細胞中加入40 μmol/L來那度胺。拍照記錄并重新放回37 ℃恒溫培養箱進行培養。48 h后再次拍照，并進行對比。遷移率=[（0 h劃痕間面積-48 h劃痕間面積）/0 h劃痕間面積]×100%。

侵襲實驗：取普通細胞以及VEGF預處理的細胞，用無FBS的DMEM培養基重懸細胞，調節細胞濃度1×106個/mL。24孔板中放置好8 μm孔徑的鋪有matrigel膠的Transwell小室，取200 μL細胞懸液加入上室，下室分別加入800 μL均含15%血清的普通培養基，40 μmol/L來那度胺，10 ng/mL VEGF。VEGF預處理組加入40 μmol/L來那度胺。培養48 h后取出Transwell小室，PBS洗滌后用4%多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色20 min，輕輕擦去上室沒有穿過的細胞。顯微鏡下記錄穿入下室的細胞數量。

1.5 蛋白表達測定

Western blotting實驗：提取NC組、Lena組、VEGF組、VEGF+Lena組細胞總蛋白。BCA法進行蛋白定量、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳、轉膜、封閉，蛋白抗體雜交、顯影步驟進行處理。以GADPH為標準，檢測E-cadherin、Vimentin、Snail、VEGF的蛋白相對表達值。

1.6 統計學分析

所有分析均在SPSS 19.0軟件中進行。取至少3次獨立實驗，獲得的數據用（）表示，多組數據間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗，P＜0.05認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度來那度胺對肝癌細胞 LM3的毒性作用及對VEGF蛋白表達的影響

不同濃度來那度胺（0、5、10、20、40、80 μmol/L）處理LM3細胞24 h和48 h后，各組細胞在450 nm處吸光度值和細胞活力與對照組比較沒有統計學差異，各實驗組之間比較也無統計學差異（P＞0.05，見圖1），這說明5～80 μmol/L濃度的來那度胺對LM3細胞活性沒有影響。

圖1 不同濃度來納度胺處理肝癌細胞LM3 24 h和48 h后細胞活性的變化

不同濃度來那度胺（0、5、1 0、2 0、4 0、80 μmol/L）處理LM3細胞48 h后五組VEGF表達量分別為（0.815±0.048），（0.798±0.035），（0.671±0.058），（0.472±0.041），（0.231±0.040），（0.183±0.027），表達量降低呈劑量依賴性，5 μmol/L和10 μmol/L組與對照組比較無統計學差異，20、40、80 μmol/L組與對照組比較均有統計學差異。由于80 μmol/L組與40 μmol/L組無統計學差異（見圖2），所以本研究采用40 μmol/L濃度來那度胺進行進一步的實驗。

圖2 不同濃度來那度胺對肝癌細胞LM3 VEGF蛋白表達的影響

2.2 來那度胺對LM3細胞遷移和侵襲的影響

觀察40 μmol/L來那度胺作用下LM3 細胞遷移和侵襲的變化。如圖3 所示，來那度胺能有效抑制LM3細胞的遷移和侵襲。具體數據見表1。

表1 不同實驗條件處理LM3細胞48 h后細胞的遷移率和侵襲數

圖3 來那度胺對LM3細胞遷移和侵襲的影響

2.3 來那度胺對EMT相關蛋白表達的影響

本研究通過蛋白印跡實驗證明，在40 μmol/L來那度胺作用下，EMT相關蛋白標志物Snail、Vimentin和VEGF蛋白表達水平下調；Snail作為E-Cadherin的轉錄抑制因子，其表達量減少使得E-cadherin表達量升高，促進細胞間黏附，從而減少細胞的侵襲性（見圖4 和表2）。而在VEGF的作用下，LM3 細胞發生EMT，引起Snail表達升高，進而抑制E-cadherin表達；且VEGF和間質標志物Vimentin表達量也明顯升高，導致細胞遷移和侵襲能力明顯增強。經VEGF預處理的細胞在來那度胺的作用下，因VEGF表達受到抑制，阻斷EMT的持續發生，因此遷移和侵襲程度較VEGF組減弱（見表2）。在此我們得出結論，來那度胺通過抑制LM3 細胞表達VEGF，從而減弱了細胞的侵襲性。

表2 不同實驗條件處理LM3細胞48 h后EMT相關蛋白的相對表達值

圖4 來那度胺對LM3細胞EMT相關蛋白表達的影響

3 討論

盡管索拉菲尼作為抗血管治療的一線藥物提高了晚期肝癌患者的總體生存率，卻常因耐藥性導致治療失敗[9]；但另一方面，抗血管治療的部分成功提示抗血管治療仍有巨大的探索空間。已有的研究證明，腸癌、鼻咽癌中腫瘤細胞通過自分泌和旁分泌的形式產生VEGF，與腫瘤細胞膜表面受體結合后激活通路，促使腫瘤發生EMT[10-11]。上皮間質轉化是指細胞失去極性并表達間充質細胞特性從而引起細胞黏附能力降低的機制[12]。

在多數腫瘤中VEGF呈現高表達，不僅誘導血管生成，使建立起血液供應系統，從而加速生長和侵襲性[12]。肝癌是一種典型的高度血管增生腫瘤，而肝癌組織中出現VEGF高表達以及術前血漿高VEGF值的患者，總生存率（OS）和無病生存率（DFS）較短[13]，因此有學者提出將VEGF指標作為診斷肝癌預后的重要指標[14]。來那度胺是一款具有抗血管生成作用的藥物，已有研究證明來那度胺通過抑制缺氧誘導因子-1（HIF-1）來抑制VEGF的表達，并且通過阻斷PI3K-AKT通路來減弱VEGF誘導的內皮細胞的成管作用[15]。在動物實驗中使用來那度胺后宮頸癌瘤塊邊緣及中心血管數量均明顯低于對照組[16]。本次實驗發現來那度胺具有抑制肝癌細胞LM3 表達VEGF的作用，且隨著藥物濃度的增加，抑制效果逐漸加強。同時來那度胺處理后增加了E-黏附蛋白的表達，減少了間充質標志物波形蛋白、Snail的表達，從而抑制了肝癌細胞LM3的遷移和侵襲。相反，VEGF與細胞表面受體結合促進LM3 細胞的EMT，增加了LM3細胞的侵襲性，并且在該過程中細胞VEGF表達升高。而來那度胺作用于VEGF預處理的細胞后，抑制了VEGF的表達，減少了其與VEGFR-1結合，因此減少了遷移和侵襲的能力。

本研究我們選用具有高度侵襲性的肝癌LM3細胞進行實驗，研究發現來那度胺對肝癌細胞的活性具有抑制作用，但是它能抑制腫瘤細胞表達VEGF，從而抑制細胞遷移和侵襲，因此具有一定的肝癌治療潛力。