不同能量平衡狀態(tài)下瘦素及瘦素受體在小鼠肝細胞損傷中的作用機制

李婷，霍泉，孫東君，路志國，杜勇

（1.寧夏醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院 小兒外科，寧夏 銀川 750004）

能量平衡是攝入和消耗的能量達到一種平衡狀態(tài)，若攝入能量大于消耗能量時為正能量平衡，若攝入能量低于消耗能量時為負能量平衡。目前能量代謝相關疾病的發(fā)病率逐年增加，最新報道發(fā)現特發(fā)性顱內高壓也是一種代謝性疾病[1]。能量代謝性疾病的作用機制也成為近年來研究中的熱點之一。在整個能量平衡調節(jié)過程中瘦素（leptin）和瘦素受體（leptin receptor，LEPR）是重要的調節(jié)分子，leptin來源于白色脂肪分泌[2]，通過肝糖原和脂肪代謝，參與能量平衡代謝過程[3]。外周leptin需與LEPR結合通過血腦屏障，作用于下丘腦從而抵抗脂質沉積[4]。研究發(fā)現敲除Mex3c基因的小鼠通過增加活動量而減少脂質儲存，并全面抵抗由飲食導致的肥胖[5]，另外發(fā)現通過調控IGF-1導致生長遲滯[6]。目前研究證實Mex3c基因主要調控leptin參與中樞能量代謝過程[7]。現就不同能量狀態(tài)下肝細胞損傷與leptin、LEPR的關系進行探討，以期為肝臟細胞損傷的防治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗動物：FVB/N雌鼠購自于賽業(yè)公司，利用CRISPR/Cas9[8]技術構建Mex3c+/-小鼠模型，所有小鼠均飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學動物中心。實驗所用飼料：（1）普通飼料（寧夏醫(yī)科大學動物中心提供）；（2）高脂飼料：預混料2.0%、磷酸氫鈣2.0%、大豆分離蛋白10.0%、豬油12.0%、蔗糖20.0%、膽固醇1.0%、維持鼠料53.0%（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型構建：對實驗小鼠進行分組：Mex3c+/-突變組（Mex3c+/-組，n=6）、高脂飲食組（HFD組，n=6）、對照組（Contorl組，n=6）。均在4周齡與母鼠分開，高脂飲食組給與混合飼料（高脂飼料和普通飼料按照1:1混合）1周后，改成高脂飼料。其余兩組一直給與普通飼料。環(huán)境溫度保持在24 ℃，光照時間8:00-20:00，每天更換墊料，所有小鼠均自由取水；每周測體質量（禁食8 h）記錄體質量變化曲線，當高脂飲食組體質量高于對照組20%，視為造模成功。

1.2.2 小鼠實驗取材：于14周齡取材，注射1%戊巴比妥鈉進行麻醉，通過心臟采血，置于4 ℃靜置2 h離心后留取血清；取血結束后迅速取出肝臟并記錄重量，置于冰上取出1 cm×1 cm肝右葉放入4%的多聚甲醛固定24 h；其余肝臟儲存于-80 ℃。

1.2.3 光鏡及免疫組化觀察：取已固定的小鼠肝臟做成4 μm厚的石蠟切片，HE染色進行光鏡觀察。取已固定小鼠肝組織制成4 μm的石蠟切片，按免疫組化兩步法檢測肝臟組織leptin（1:1 200）、LEPR（1:1 200）蛋白表達，經Image-Pro-Plus6.0 軟件分析leptin和LEPR蛋白表達。

1.2.4 RNA提取及cDNA轉錄：取肝臟組織40 mg，轉移到消毒好研磨缽中，加液氮研磨成粉末，按照使用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒得到RNA，根據RT-PCR試劑盒反轉錄cDNA：反應條件42 ℃孵育15 min，85 ℃加熱5 s。引物設計：LEPR正義鏈5’-CGTGGTCAGAAGATGTGG-3’，反義鏈5’-CAGG AAAGGATGACAGC-3’。按照Tip Green qPCR Super Mix的兩步法實驗。

1.2.5 蛋白表達檢測：采用Western blotting法。取40 mg肝臟組織，按照凱基全蛋白提取試劑盒方法獲取蛋白，按照BCA蛋白含量檢測試劑盒測蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液，煮沸后經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電（SDS-PAGE、8%）分離蛋白，轉膜，5%脫脂牛奶封閉，TBST洗膜后，分別孵育一抗β-actin（1:5 000）、leptin（1:3 000）、LEPR（1:2 000）、4 ℃過夜，二抗常溫孵育1.5 h（1:10 000），電化學發(fā)光法（ECL）顯色曝光，經Image J軟件處理并分析圖像。

1.2.6 LEPR、ALT、AST及膽紅素檢測：取血清置于冰上解凍，按照BSTER試劑盒進行操作。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組動物體質量差異

4 周齡時HFD組與Control組體質量相近，HFD組經過10 周高脂飼料飼養(yǎng)。3 組小鼠14 周齡體質量結果顯示Control組（18.20±1.04）g、Mex3c+/-組（15.23±0.57）g、HFD組（21.56±2.56）g；與Control組相比，Mex3c+/-組體質量降低（P＜0.01），HFD組體質量增加（P＜0.01）。

2.2 各組小鼠肝臟組織形態(tài)差異

光鏡下Control組肝細胞包膜、胞核完整，肝小葉結構清晰可見；Mex3c+/-組肝小葉結構完整，肝細胞內有小脂滴，沒有HFD組脂肪變明顯；HFD組的肝小葉結構損傷但基本結構可見，肝細胞增大、細胞核萎縮，甚至細胞無核徹底空泡化，被大量脂滴充斥。見圖1。

圖1 光鏡下各組小鼠肝臟組織形態(tài)（HE，×40）

2.3 各組小鼠肝臟組織中LEPR的mRNA相對表達量

與Control組（1.01±0.02）相比，Mex3c+/-組LEPR mRNA表達略升高（1.44±0.30），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但HFD組明顯升高（1.90±0.37）（P＜0.05）。

2.4 各組小鼠血清中可溶性LEPR濃度差異

血清中含可溶性LEPR，可以通過血腦屏障，在下丘腦發(fā)揮功能。當leptin與血清中的LEPR結合通過血腦屏障轉運到大腦，進而參與下丘腦對食欲調控。ELISA測LEPR結果顯示，與Control組[（2 011.60±589.07）pg/mL]相比，Mex3c+/-組血清中可溶性LEPR濃度[（1 873.62±643.49）pg/mL]略下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），HFD組明顯升高[（7 264.33±1 640.83）pg/mL，P＜0.01]。

2.5 各組小鼠leptin、LEPR在肝細胞中蛋白表達情況

免疫組化染色結果顯示：leptin在細胞核表達，LEPR主要在細胞膜上表達但由于肝臟也可以分泌LEPR，因此胞漿內可見LEPR蛋白表達，圖片中黃色或棕色為陽性表達（紅色箭頭所指）。3 組肝臟組織leptin蛋白表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；3 組肝臟組織LEPR蛋白表達結果顯示，與Control組相比，Mex3c+/-組和HFD組均高表達LEPR蛋白（P＜0.01，P＜0.001）。見圖2～3。

圖2 各組小鼠肝臟組織leptin、LEPR免疫組化（×40）

圖3 各組小鼠肝臟組織leptin、LEPR免疫組化數據

Western blotting結果顯示：3組leptin蛋白水平無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。與Control組相比，Mex3c+/-組和HFD組肝臟組織leptin蛋白水平差異不大，不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但Mex3c+/-組和HFD組LEPR蛋白升高明顯，以HFD組表達水平最高（P＜0.01）。具體見圖4、圖5。

圖5 小鼠肝臟組織leptin、LEPR蛋白表達數據

圖4 各組小鼠肝臟組織中l(wèi)eptin、LEPR蛋白表達電泳圖

2.6 各組小鼠血清ALT、AST、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）水平比較

與Control組比，Mex3c+/-組血清ALT、AST水平降低（P＜0.05），但TBIL、DBIL水平升高（P＜0.05）；但HFD組血清ALT、AST、TBIL和DBIL水平均升高（P＜0.05）。具體見表1。

表1 三組小鼠血清ALT、AST、TBIL、DBIL濃度水平比較（）

表1 三組小鼠血清ALT、AST、TBIL、DBIL濃度水平比較（）

注：P1，Control組與Mex3c+/-組比較；P2，Control組與HFD組比較；P3，Mex3c+/-組與HFD組比較。

3 討論

能量平衡取決于食物的攝入與消耗之間是否平衡，相關研究已經發(fā)現，瘦素或者饑餓激素通過調控突觸后C-FOS表達參與能量平衡[9]。為了探索不同能量平衡狀態(tài)下肝臟細胞是否有損傷，本實驗通過敲除Mex3c基因誘導負能量狀態(tài)，高脂飲食誘導正能量狀態(tài)；定期測定小鼠體質量，當HFD組動物體質量高于Control組體質量20%時為造模成功，結果表明模型構建成功。測定ALT、AST、DBIL、TBIL指標結果顯示，與Control組相比，Mex3c+/-組ALT、AST降低而TBIL、DBIL升高；HFD組的ALT、AST、TBIL、DBIL指標均升高。關于負能量平衡中酶與膽紅素表達結果不一致原因，推測Mex3c基因誘導機體處于負能量平衡狀態(tài)，可能導致機體合成谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶降低，而膽紅素中直接膽紅素占總膽紅素比值在50%，提示肝臟細胞損傷。為了探究肝功能損傷原因，首先觀察肝臟病理結果。HE染色結果顯示，HFD組、Mex3c+/-組肝臟細胞內有大小不一脂滴沉積，這提示正負能量狀態(tài)下肝臟細胞可能存在脂代謝紊亂。在正常人體內，脂質合成與分解處于動態(tài)平衡中，維持機體對能量需求；但長期高脂飲食會致使脂質沉積，脂肪增多，打破人體脂質代謝平衡，誘發(fā)非酒精性脂肪肝[10]，邵華等[11]實驗同樣發(fā)現，高脂飲食可以誘導小鼠形成脂肪肝。在Mex3c+/-突變小鼠誘導負能量狀態(tài)的肝細胞中觀察到脂滴沉積，可能與長期處于負能量狀態(tài)誘導高非酯化脂肪酸（NEFA），適量的NEFA被肝臟吸收用于氧化生成能量，而大量的NEFA會產生酮體進而脂化，再次形成脂質沉積肝臟[12]。

課題組在前期實驗中已經證明Mex3c基因缺陷小鼠誘導機體形成負能量狀態(tài)[5]；通過誘導下丘腦內C-FOS表達參與能量代謝研究[13]。經過多年研究，學者們已經證實下丘腦是能量代謝的中樞系統(tǒng)，可以通過調控leptin-LEPR進而調節(jié)食物的攝入與排出[14]。Thaler JP等[15]發(fā)現人類和嚙齒動物的肥胖與下丘腦損傷有關。高脂飲食可以使下丘腦炎癥損傷和增加內質網應激作用，進而導致leptin和胰島素敏感性下降[10，16]。肝臟作為外周代謝中心器官，基于實驗結果得知正負能量平衡會導致肝功能下降。其次檢測肝臟組織內leptin、LEPR蛋白表達結果。實驗組間leptin蛋白表達無統(tǒng)計學差異，除了能量狀態(tài)會影響leptin分泌，還與促性腺激素、甲狀腺激素及生長激素以及l(fā)eptin自身調節(jié)有關[14]。繼續(xù)檢測LEPR蛋白的表達水平，結果顯示HFD組、Mex3c+/-組肝臟組織高表達LEPR蛋白，Coleman等[17]發(fā)現LEPR蛋白升高會增加基礎代謝和脂代謝過程。與病理學染色結果一致，高脂飲食組和Mex3c+/-組肝細胞中存在大小不一脂滴，表明可能存在脂代謝紊亂；可能與長期高表達LEPR致使leptin發(fā)生抵抗，抑制胰島素分泌相關[18]。結合血清可溶性LEPR結果，當leptin發(fā)生抵抗時，致使HFD組LEPR高表達，其結合敏感度減低；但Mex3c+/-組可溶性LEPR水平低，推測與此基因導致機體負能量狀態(tài)，白色脂肪少，導致分泌leptin減少，進而導致血清中LEPR低表達。

基于上述實驗結果，正能量平衡通過攝取過多營養(yǎng)而導致肝細胞損傷，據莊波等[19]研究，吲哚菁綠清除試驗可以評估剩余肝功能，可以利用此實驗進一步完善肝功能的評估。而Mex3c缺陷小鼠誘發(fā)機體產生負能量平衡，ALT、AST低表達，而膽紅素指標高表達，推測Mex3c誘導機體營養(yǎng)不良進而導致機體合成ALT、AST原料減少；但為了維持機體對能量需求，可能將外周脂肪進行非酯化，轉入肝細胞中提供能量，若酯化物過多，導致肝細胞損傷，引起膽紅素升高。Chao等[20]研究表明，Mex3c+/-促進聚積脂質、細胞黏附、侵襲和遷移，可能與含有EH結構相關；除此之外，Cao等[21]研究發(fā)現，Mex3c通過負調節(jié)FGF14加速了骨肉瘤的惡性進程，這些表明Mex3c基因仍有許多未解之謎。最新研究發(fā)現，雌性小鼠可增強線粒體功能，抵抗高脂飲食誘導脂肪變性，通過補充雌二醇可以改善小鼠卵巢切除后誘發(fā)的膽汁酸代謝障礙[22]，這為以后研究提供新思路。在leptin-LEPR參與的肝細胞損傷中，LEPR比leptin更具有意義，但目前的研究資料有限，leptin-LEPR是否通過影響線粒體功能參與到肝臟細胞損傷紊亂，有待進一步研究，尋找到關鍵的作用靶點。