不同能量平衡狀態下瘦素及瘦素受體在小鼠肝細胞損傷中的作用機制

李婷，霍泉，孫東君，路志國，杜勇

（1.寧夏醫科大學 臨床醫學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫科大學總醫院 小兒外科，寧夏 銀川 750004）

能量平衡是攝入和消耗的能量達到一種平衡狀態，若攝入能量大于消耗能量時為正能量平衡，若攝入能量低于消耗能量時為負能量平衡。目前能量代謝相關疾病的發病率逐年增加，最新報道發現特發性顱內高壓也是一種代謝性疾病[1]。能量代謝性疾病的作用機制也成為近年來研究中的熱點之一。在整個能量平衡調節過程中瘦素（leptin）和瘦素受體（leptin receptor，LEPR）是重要的調節分子，leptin來源于白色脂肪分泌[2]，通過肝糖原和脂肪代謝，參與能量平衡代謝過程[3]。外周leptin需與LEPR結合通過血腦屏障，作用于下丘腦從而抵抗脂質沉積[4]。研究發現敲除Mex3c基因的小鼠通過增加活動量而減少脂質儲存，并全面抵抗由飲食導致的肥胖[5]，另外發現通過調控IGF-1導致生長遲滯[6]。目前研究證實Mex3c基因主要調控leptin參與中樞能量代謝過程[7]。現就不同能量狀態下肝細胞損傷與leptin、LEPR的關系進行探討，以期為肝臟細胞損傷的防治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗動物：FVB/N雌鼠購自于賽業公司，利用CRISPR/Cas9[8]技術構建Mex3c+/-小鼠模型，所有小鼠均飼養于寧夏醫科大學動物中心。實驗所用飼料：（1）普通飼料（寧夏醫科大學動物中心提供）；（2）高脂飼料：預混料2.0%、磷酸氫鈣2.0%、大豆分離蛋白10.0%、豬油12.0%、蔗糖20.0%、膽固醇1.0%、維持鼠料53.0%（江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型構建：對實驗小鼠進行分組：Mex3c+/-突變組（Mex3c+/-組，n=6）、高脂飲食組（HFD組，n=6）、對照組（Contorl組，n=6）。均在4周齡與母鼠分開，高脂飲食組給與混合飼料（高脂飼料和普通飼料按照1:1混合）1周后，改成高脂飼料。其余兩組一直給與普通飼料。環境溫度保持在24 ℃，光照時間8:00-20:00，每天更換墊料，所有小鼠均自由取水；每周測體質量（禁食8 h）記錄體質量變化曲線，當高脂飲食組體質量高于對照組20%，視為造模成功。

1.2.2 小鼠實驗取材：于14周齡取材，注射1%戊巴比妥鈉進行麻醉，通過心臟采血，置于4 ℃靜置2 h離心后留取血清；取血結束后迅速取出肝臟并記錄重量，置于冰上取出1 cm×1 cm肝右葉放入4%的多聚甲醛固定24 h；其余肝臟儲存于-80 ℃。

1.2.3 光鏡及免疫組化觀察：取已固定的小鼠肝臟做成4 μm厚的石蠟切片，HE染色進行光鏡觀察。取已固定小鼠肝組織制成4 μm的石蠟切片，按免疫組化兩步法檢測肝臟組織leptin（1:1 200）、LEPR（1:1 200）蛋白表達，經Image-Pro-Plus6.0 軟件分析leptin和LEPR蛋白表達。

1.2.4 RNA提取及cDNA轉錄：取肝臟組織40 mg，轉移到消毒好研磨缽中，加液氮研磨成粉末，按照使用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒得到RNA，根據RT-PCR試劑盒反轉錄cDNA：反應條件42 ℃孵育15 min，85 ℃加熱5 s。引物設計：LEPR正義鏈5’-CGTGGTCAGAAGATGTGG-3’，反義鏈5’-CAGG AAAGGATGACAGC-3’。按照Tip Green qPCR Super Mix的兩步法實驗。

1.2.5 蛋白表達檢測：采用Western blotting法。取40 mg肝臟組織，按照凱基全蛋白提取試劑盒方法獲取蛋白，按照BCA蛋白含量檢測試劑盒測蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液，煮沸后經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電（SDS-PAGE、8%）分離蛋白，轉膜，5%脫脂牛奶封閉，TBST洗膜后，分別孵育一抗β-actin（1:5 000）、leptin（1:3 000）、LEPR（1:2 000）、4 ℃過夜，二抗常溫孵育1.5 h（1:10 000），電化學發光法（ECL）顯色曝光，經Image J軟件處理并分析圖像。

1.2.6 LEPR、ALT、AST及膽紅素檢測：取血清置于冰上解凍，按照BSTER試劑盒進行操作。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組動物體質量差異

4 周齡時HFD組與Control組體質量相近，HFD組經過10 周高脂飼料飼養。3 組小鼠14 周齡體質量結果顯示Control組（18.20±1.04）g、Mex3c+/-組（15.23±0.57）g、HFD組（21.56±2.56）g；與Control組相比，Mex3c+/-組體質量降低（P＜0.01），HFD組體質量增加（P＜0.01）。

2.2 各組小鼠肝臟組織形態差異

光鏡下Control組肝細胞包膜、胞核完整，肝小葉結構清晰可見；Mex3c+/-組肝小葉結構完整，肝細胞內有小脂滴，沒有HFD組脂肪變明顯；HFD組的肝小葉結構損傷但基本結構可見，肝細胞增大、細胞核萎縮，甚至細胞無核徹底空泡化，被大量脂滴充斥。見圖1。

圖1 光鏡下各組小鼠肝臟組織形態（HE，×40）

2.3 各組小鼠肝臟組織中LEPR的mRNA相對表達量

與Control組（1.01±0.02）相比，Mex3c+/-組LEPR mRNA表達略升高（1.44±0.30），差異無統計學意義（P＞0.05），但HFD組明顯升高（1.90±0.37）（P＜0.05）。

2.4 各組小鼠血清中可溶性LEPR濃度差異

血清中含可溶性LEPR，可以通過血腦屏障，在下丘腦發揮功能。當leptin與血清中的LEPR結合通過血腦屏障轉運到大腦，進而參與下丘腦對食欲調控。ELISA測LEPR結果顯示，與Control組[（2 011.60±589.07）pg/mL]相比，Mex3c+/-組血清中可溶性LEPR濃度[（1 873.62±643.49）pg/mL]略下降，但差異無統計學意義（P＞0.05），HFD組明顯升高[（7 264.33±1 640.83）pg/mL，P＜0.01]。

2.5 各組小鼠leptin、LEPR在肝細胞中蛋白表達情況

免疫組化染色結果顯示：leptin在細胞核表達，LEPR主要在細胞膜上表達但由于肝臟也可以分泌LEPR，因此胞漿內可見LEPR蛋白表達，圖片中黃色或棕色為陽性表達（紅色箭頭所指）。3 組肝臟組織leptin蛋白表達無統計學差異（P＞0.05）；3 組肝臟組織LEPR蛋白表達結果顯示，與Control組相比，Mex3c+/-組和HFD組均高表達LEPR蛋白（P＜0.01，P＜0.001）。見圖2～3。

圖2 各組小鼠肝臟組織leptin、LEPR免疫組化（×40）

圖3 各組小鼠肝臟組織leptin、LEPR免疫組化數據

Western blotting結果顯示：3組leptin蛋白水平無統計學差異（P＞0.05）。與Control組相比，Mex3c+/-組和HFD組肝臟組織leptin蛋白水平差異不大，不具有統計學意義（P＞0.05），但Mex3c+/-組和HFD組LEPR蛋白升高明顯，以HFD組表達水平最高（P＜0.01）。具體見圖4、圖5。

圖5 小鼠肝臟組織leptin、LEPR蛋白表達數據

圖4 各組小鼠肝臟組織中leptin、LEPR蛋白表達電泳圖

2.6 各組小鼠血清ALT、AST、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）水平比較

與Control組比，Mex3c+/-組血清ALT、AST水平降低（P＜0.05），但TBIL、DBIL水平升高（P＜0.05）；但HFD組血清ALT、AST、TBIL和DBIL水平均升高（P＜0.05）。具體見表1。

表1 三組小鼠血清ALT、AST、TBIL、DBIL濃度水平比較（）

表1 三組小鼠血清ALT、AST、TBIL、DBIL濃度水平比較（）

注：P1，Control組與Mex3c+/-組比較；P2，Control組與HFD組比較；P3，Mex3c+/-組與HFD組比較。

3 討論

能量平衡取決于食物的攝入與消耗之間是否平衡，相關研究已經發現，瘦素或者饑餓激素通過調控突觸后C-FOS表達參與能量平衡[9]。為了探索不同能量平衡狀態下肝臟細胞是否有損傷，本實驗通過敲除Mex3c基因誘導負能量狀態，高脂飲食誘導正能量狀態；定期測定小鼠體質量，當HFD組動物體質量高于Control組體質量20%時為造模成功，結果表明模型構建成功。測定ALT、AST、DBIL、TBIL指標結果顯示，與Control組相比，Mex3c+/-組ALT、AST降低而TBIL、DBIL升高；HFD組的ALT、AST、TBIL、DBIL指標均升高。關于負能量平衡中酶與膽紅素表達結果不一致原因，推測Mex3c基因誘導機體處于負能量平衡狀態，可能導致機體合成谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶降低，而膽紅素中直接膽紅素占總膽紅素比值在50%，提示肝臟細胞損傷。為了探究肝功能損傷原因，首先觀察肝臟病理結果。HE染色結果顯示，HFD組、Mex3c+/-組肝臟細胞內有大小不一脂滴沉積，這提示正負能量狀態下肝臟細胞可能存在脂代謝紊亂。在正常人體內，脂質合成與分解處于動態平衡中，維持機體對能量需求；但長期高脂飲食會致使脂質沉積，脂肪增多，打破人體脂質代謝平衡，誘發非酒精性脂肪肝[10]，邵華等[11]實驗同樣發現，高脂飲食可以誘導小鼠形成脂肪肝。在Mex3c+/-突變小鼠誘導負能量狀態的肝細胞中觀察到脂滴沉積，可能與長期處于負能量狀態誘導高非酯化脂肪酸（NEFA），適量的NEFA被肝臟吸收用于氧化生成能量，而大量的NEFA會產生酮體進而脂化，再次形成脂質沉積肝臟[12]。

課題組在前期實驗中已經證明Mex3c基因缺陷小鼠誘導機體形成負能量狀態[5]；通過誘導下丘腦內C-FOS表達參與能量代謝研究[13]。經過多年研究，學者們已經證實下丘腦是能量代謝的中樞系統，可以通過調控leptin-LEPR進而調節食物的攝入與排出[14]。Thaler JP等[15]發現人類和嚙齒動物的肥胖與下丘腦損傷有關。高脂飲食可以使下丘腦炎癥損傷和增加內質網應激作用，進而導致leptin和胰島素敏感性下降[10，16]。肝臟作為外周代謝中心器官，基于實驗結果得知正負能量平衡會導致肝功能下降。其次檢測肝臟組織內leptin、LEPR蛋白表達結果。實驗組間leptin蛋白表達無統計學差異，除了能量狀態會影響leptin分泌，還與促性腺激素、甲狀腺激素及生長激素以及leptin自身調節有關[14]。繼續檢測LEPR蛋白的表達水平，結果顯示HFD組、Mex3c+/-組肝臟組織高表達LEPR蛋白，Coleman等[17]發現LEPR蛋白升高會增加基礎代謝和脂代謝過程。與病理學染色結果一致，高脂飲食組和Mex3c+/-組肝細胞中存在大小不一脂滴，表明可能存在脂代謝紊亂；可能與長期高表達LEPR致使leptin發生抵抗，抑制胰島素分泌相關[18]。結合血清可溶性LEPR結果，當leptin發生抵抗時，致使HFD組LEPR高表達，其結合敏感度減低；但Mex3c+/-組可溶性LEPR水平低，推測與此基因導致機體負能量狀態，白色脂肪少，導致分泌leptin減少，進而導致血清中LEPR低表達。

基于上述實驗結果，正能量平衡通過攝取過多營養而導致肝細胞損傷，據莊波等[19]研究，吲哚菁綠清除試驗可以評估剩余肝功能，可以利用此實驗進一步完善肝功能的評估。而Mex3c缺陷小鼠誘發機體產生負能量平衡，ALT、AST低表達，而膽紅素指標高表達，推測Mex3c誘導機體營養不良進而導致機體合成ALT、AST原料減少；但為了維持機體對能量需求，可能將外周脂肪進行非酯化，轉入肝細胞中提供能量，若酯化物過多，導致肝細胞損傷，引起膽紅素升高。Chao等[20]研究表明，Mex3c+/-促進聚積脂質、細胞黏附、侵襲和遷移，可能與含有EH結構相關；除此之外，Cao等[21]研究發現，Mex3c通過負調節FGF14加速了骨肉瘤的惡性進程，這些表明Mex3c基因仍有許多未解之謎。最新研究發現，雌性小鼠可增強線粒體功能，抵抗高脂飲食誘導脂肪變性，通過補充雌二醇可以改善小鼠卵巢切除后誘發的膽汁酸代謝障礙[22]，這為以后研究提供新思路。在leptin-LEPR參與的肝細胞損傷中，LEPR比leptin更具有意義，但目前的研究資料有限，leptin-LEPR是否通過影響線粒體功能參與到肝臟細胞損傷紊亂，有待進一步研究，尋找到關鍵的作用靶點。