蘆丁對高脂高糖飲食造成的小鼠腦損傷的保護作用

周勇兵,馬新壯,余麗麗,湯雨婷,王 力*

(1蚌埠醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室,蚌埠 233030;2慢性疾病免疫學基礎與臨床安徽省重點實驗室;*通訊作者,E-mail:wangli@bbmc.edu.cn)

當代社會,由飲食誘導肥胖引起的各種健康問題備受關注。單純性肥胖(obesity)是由多因素引起的體內脂肪積累過多而影響人類健康的慢性流行性疾病。它是一種涉及遺傳、代謝、激素和行為成分的慢性疾病[1]。肥胖的發(fā)生會引起多種代謝并發(fā)癥,導致人體內各臟器不同程度氧化損傷,除了內源性防御外,減少氧化還原的均衡飲食在預防由氧化損傷所導致疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[2]。肥胖導致的臟器氧化損傷日益積累會導致細胞功能損害。為了淬滅自由基或減少氧化產物,研究者不斷尋找天然高效的化學成分等天然抗氧化物質。希望這類天然抗氧化物質能在控制肥胖以及抵抗因肥胖而產生的危害上發(fā)揮重要作用。黃酮類物質是一類多酚類化合物,其具有平喘、抗氧化、抗炎等多重生物學活性[3],蘆丁(rutin)作為黃酮類物質典型代表,廣泛存在于桑葚、葡萄、茶葉、蔬菜等植物中,具有多種生理藥理活性[4],可預防和治療由高脂飲食引起肥胖所導致的多種代謝性疾病,Choi等[5]研究發(fā)現蘆丁具有抑制脂肪前體細胞形成的作用,Hamit等[6]研究發(fā)現蘆丁對大鼠大腦組織中因大腸菌素誘導產生的氧化損傷具有神經保護作用。因此,本研究通過建立蘆丁干預高糖或高脂飲食誘導ICR雄性小鼠營養(yǎng)肥胖模型,來探索蘆丁在小鼠腦脂質氧化損傷中所起的抗氧化作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

蘆丁(純度≥98%,C27H30O16,百靈威),4%多聚甲醛(塞維爾生物科技公司),甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所),其他化學試劑均為分析純。KDC-160HR高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新公司),DY89-Ι型電動玻璃勻漿機(寧波新芝有限公司),Synergy2型酶標儀(Biotek,美國)。

1.2 實驗動物

SPF級ICR雄性小鼠40只,購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場,動物合格證號為SCXK(滬)2013-0006,體質量22-24 g。各組小鼠在12 h/12 h晝夜交替循環(huán)時間,20-25 ℃室溫和50%-60%濕度的標準條件下喂養(yǎng)。實驗處理及過程經蚌埠醫(yī)學院實驗動物倫理委員會審批(倫動科批字[2018]第006號),符合動物倫理要求。

1.3 指標檢測及方法

1.3.1 分組和構建模型 顆粒狀嚙齒動物飼料適應性喂養(yǎng)1周后,隨機均等分為:正常組,喂養(yǎng)普通飼料(小麥19%,玉米38%,麩皮14%,豆粕12%,魚粉8%,雞蛋3%,其他灰分6%);高脂組,喂養(yǎng)高脂飼料(78.8%普通飼料,豬油10%,蛋黃粉10%,膽固醇1%以及膽鹽0.2%);高糖組,喂養(yǎng)普通飼料+60%的高葡萄糖溶液;蘆丁+高脂組,喂養(yǎng)高脂飼料+蘆丁飽和水溶液;蘆丁+高糖組,喂養(yǎng)普通飼料+混合溶液(60%的高葡萄糖溶液+蘆丁飽和水溶液)。小鼠可自由飲水和攝食。蘆丁+高脂組和蘆丁+高糖組所用蘆丁水溶液為1 g蘆丁溶于1 L ddH2O,每天均超聲半小時后使用。每日觀察、每周稱重、記錄。

1.3.2 組織采集及處理 適宜實驗環(huán)境飼養(yǎng)120 d后,禁食一晚。摘眼球取血,血液樣本分離血清進行分析。處死小鼠后快速解剖,用4%多聚甲醛固定部分分離出大腦組織和海馬組織,作Nissl染色和HE染色,其余腦組織先用液氮冷凍,然后在-80 ℃冰箱中保存,后續(xù)用于相關氧化應激指標和生化指標檢測。

1.3.3 腦組織病理學檢查 大腦皮層區(qū)和海馬區(qū)分離組織,經4%多聚甲醛溶液固定,石蠟包埋,分別連續(xù)切取4-6 μm厚切片,進行尼氏(Nissl)染色(甲苯胺藍 ∶無水乙醇=1 ∶1,與新鮮的0.1%NaCl溶液混合)和蘇木精-伊紅(HE)染色,室溫下染色30 min,沖洗切片,二甲苯透明,封片,光學顯微鏡觀察、拍照。

1.3.4 小鼠血清中TG、TC含量測定 眼眶采集血樣,室溫靜置30 min后,分離血清,用試劑盒測定血清中TG、TC的含量。

1.3.5 腦組織中MDA含量及抗氧化酶SOD、GSH-Px活性水平測定 用生理鹽水(0.9%NaCl溶液)洗滌腦組織,剪碎后混勻,制成10%腦組織勻漿,離心10 min后收集上清。測定腦組織勻漿上清中SOD、GSH-Px活性水平及MDA含量。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 體質量變化

與正常組相比,高脂組小鼠體質量呈增長趨勢,第4周開始增長趨勢較快,第9周開始差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與高脂組相比,蘆丁+高脂組一開始就表現出體質量增長較緩,第9周開始差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表1)。與正常組相比,高糖組小鼠體質量也呈增長趨勢,第9周開始差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與高糖組相比,蘆丁+高糖組表現出體質量增長較緩趨勢,但無明顯減輕,第12周開始差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表2)。

表1 蘆丁干預高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的體質量比較

表2 蘆丁干預高糖飲食喂養(yǎng)小鼠的體質量比較

2.2 各組小鼠大腦皮層和海馬區(qū)組織變化

HE染色可見,正常組大腦皮層及海馬區(qū)結構完整,形態(tài)正常,神經細胞排列規(guī)則,清晰;高脂組和高糖組可見部分神經細胞排列紊亂,輕度水腫,邊緣有細胞凋亡現象;而經蘆丁干預后,蘆丁+高脂組和蘆丁+高糖組水腫減輕,病理損傷明顯改善(見圖1)。尼氏染色結果顯示,正常組大腦皮層細胞排列緊密,細胞核淡染,胞質中可見大量深染的粗顆?；郀頝issl小體;高脂組和高糖組小鼠大腦皮層結構變薄,神經細胞數量明顯減少,部分細胞核固縮,虎斑結構明顯減少;而經蘆丁干預后,蘆丁+高脂組和蘆丁+高糖組細胞排列較高脂組和高糖組規(guī)整,虎斑結構數量增加(見圖2)。

藍色箭頭:細胞排列紊亂;紅色箭頭:輕度水腫、空泡;黑色箭頭:細胞凋亡、細胞核固縮。圖1 各組小鼠腦組織形態(tài)學比較 (×40)Figure 1 Morphological changes of mouse brain tissues in each group (×40)

黑色箭頭:虎斑結構;紅色箭頭:輕度水腫、空泡圖2 蘆丁對各組小鼠大腦皮層及海馬區(qū)神經元分布的影響Figure 2 Effect of rutin on the distribution of neurons in the cerebral cortex and hippocampus of mice in each group

2.3 小鼠大腦組織中總膽固醇(TG)、甘油三酯(TC)的含量變化

HFD組血清中TG、TC含量較正常組均顯著增高(P<0.05),rutin+HFD組TG、TC含量與HFD組相比明顯降低(P<0.05)。與正常組相比,HGD組TG、TC含量無明顯變化;與HGD組相比,rutin+HGD組TG、TC含量明顯降低(P<0.05,見表3,4)。

表3 蘆丁干預對高脂飲食小鼠大腦TG、TC含量的影響

表4 蘆丁干預對高糖飲食小鼠大腦TG、TC含量的影響

2.4 蘆丁對小鼠腦MDA含量和SOD、GSH-Px活性變化的影響

小鼠腦氧化應激檢測結果顯示,HFD組和HGD組腦組織勻漿中MDA含量顯著高于正常組(P<0.05);經蘆丁干預后,rutin+HFD組MDA含量與HFD組相比恢復到正常水平(P<0.05),rutin+HGD組MDA含量有所下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與正常組相比,HGD組GSH-Px活性水平顯著降低(P<0.05);而rutin+HGD組GSH-Px活性水平與HGD組相比升高(P<0.05,見表5,6)。

表5 蘆丁干預對高脂飲食小鼠大腦MDA含量、GSH-Px和T-SOD活性的影響

表6 Rutin干預對高糖飲食小鼠大腦MDA含量、GSH-PX和T-SOD活性的影響

3 討論

神經組織代謝旺盛,其相關抗氧化性能較弱,以及由于其所處的高耗氧狀態(tài),大腦相對于身體其他部分而言更容易受到氧化損傷[7]。本實驗結果顯示,高脂、高糖組小鼠體質量明顯增加,TG和TC含量均有增加,大量的脂類和糖類攝入可能造成脂代謝紊亂,從而導致機體氧化應激進而促使血液中的TG運送到組織器官[8]。蘆丁干預后,對脂代謝紊亂改善有積極作用。MDA、SOD和GSH-Px可一同反應體內氧化應激水平。MDA是用作檢測和定量包括大腦在內的任何機體組織脂質過氧化反應程度的代謝產物之一[9,10],SOD能夠比較直觀地反應人體抗氧化能力和過氧化水平[11-13]。高脂組和高糖組腦組織勻漿MDA含量顯著升高,SOD水平明顯下降,經蘆丁干預后,檢測指標恢復到正常水平。GSH-Px主要通過催化H2O2及其他脂類氫過氧化物分解為GSH和水來減少氫過氧化物含量,保護腦細胞免受氧化損傷,維持細胞正常形態(tài)[14],因此在高脂組中GSH-Px水平增加。高糖組GSH-Px活性水平降低,則可能與小鼠的氧化應激適應性有關[15]。組織切片分析也發(fā)現,高脂組和高糖組尼氏體顯著減少,神經細胞中蛋白質合成和包裝的功能可能受到影響,其合成相關抗氧化酶類功能也相應減弱。

現有研究認為,在持續(xù)高脂高糖條件下,腦組織的線粒體功能障礙[16],其結果是過多的氧自由基在腦組織逐漸積累,由于細胞中的核酸、蛋白質等分子結構被破壞,進而引起神經細胞功能損傷甚至死亡[17],造成神經元病理改變[18],這與本研究的腦組織染色結果相同。Rubiolo等[19]研究發(fā)現,維持機體氧化還原動態(tài)平衡需要自由基參與,抗氧化酶與自由基相互作用,使自由基毒性減少,水溶性增加,從而促進自由基清除。當抗氧化酶類受到氧化應激損傷時,需要外源化學物質改善氧化水平,蘆丁保護組的保護作用可能是蘆丁通過將氫原子推向超氧陰離子自由基、過氧自由基和羥基來清除腦內的氧自由基,以減輕腦內氧化應激水平[20]。同時,通過對小鼠行為變化觀察發(fā)現,高脂組和高糖組小鼠出現了行動遲緩,嗜睡現象,這可能是因脂質過氧化損傷,逐漸受損的大腦皮層功能區(qū)導致正常認知修復功能減退[21]。

本研究的不足之處在于本實驗沒有對小鼠攝食量進行精確的統(tǒng)計與記錄,不能完全排除rutin影響攝食量從而對體質量及氧化產物等產生影響的可能性。這是我們實驗設計之初沒有考慮到的地方,也使整個實驗存在一定的不嚴謹之處。我們會在后續(xù)實驗中完善這方面的設計,使得實驗更加嚴謹,結果更加可靠。

綜上所述,蘆丁在小鼠大腦氧化損傷中所起到的顯著保護作用,很可能歸因于其上調了抗氧化酶類表達,在一定程度上減輕了腦組織神經細胞氧化應激損傷,為蘆丁在高脂高糖飲食誘導的小鼠腦內氧化應激損傷的保護作用提供實驗基礎。因此,蘆丁對大腦氧化應激損傷的治療潛能及具體機制,還需要更多的實驗研究證據支持,尤其是臨床研究。