蛹蟲草N6-(2-羥乙基)腺苷與多糖組合給藥對小鼠睡眠的影響

聶開美 杜思邈 陳 梅 李成溪 吳玉乾 陳玉皎,2* 曹 軍*

蛹蟲草N6-(2-羥乙基)腺苷與多糖組合給藥對小鼠睡眠的影響

聶開美1杜思邈1陳 梅1李成溪1吳玉乾1陳玉皎1,2*曹 軍1*

（1. 貴州貴安精準醫學研究院股份有限公司，貴州 貴安 561113；2. 重慶大學生物工程學院，生物流變科學與技術教育部重點實驗室，重慶 400044）

為開發出預防和治療失眠的食用菌保健食品或藥品，以蛹蟲草為原料獲得蟲草多糖和N6-(2-羥乙基)腺苷，采用45%的蟲草多糖配比55%的N6-(2-羥乙基)腺苷組合給藥小白鼠，通過小鼠自發活動實驗、延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗等，觀察組合給藥對小鼠鎮靜催眠的的影響，并進一步開展小鼠急性毒性實驗初步考察配比給藥的安全劑量。結果：N6-(2-羥乙基)腺苷與蟲草多糖在實驗配比條件下給藥，可改善小鼠睡眠質量，與單獨N6-（2-羥乙基）腺苷給藥相比，提高了小鼠入睡率。

蛹蟲草；N6-(2-羥乙基)腺苷；蟲草多糖；藥理作用；睡眠

失眠是指機體內在氣血、臟腑功能失調，導致經常性睡眠時間不足的一種病癥[1]，會出現注意力不集中、理解能力下降等癥狀[2]。傳統抗失眠藥物副作用大，致依賴性較強，因此開發健康的預防和治療失眠的食品或藥品，成為科學研究的新方向。中醫認為治療失眠時應治未病[3]。非處方藥圣約翰草提取物能改善失眠及焦慮，在歐洲、美國得到廣泛應用[4]。文獻報道許多天然藥物如冬蟲夏草、花生葉、半夏湯等的提取物也具有良好的鎮靜作用[5]，但這些天然藥物都具有服藥劑量大、服用時間長等缺點。

蛹蟲草（），亦稱北冬蟲夏草，在分類學上與冬蟲夏草同歸于蟲草屬，是一種珍貴的藥用真菌，具有較高的藥用價值。有關研究表明，蛹蟲草含有蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖和超氧化物歧化酶等生物活性物質，蛋白質、脂類、糖類、維生素及對人體有益的微量元素含量也十分豐富[6]。由于冬蟲夏草對生長環境的要求苛刻，導致資源極為有限而不能滿足日益增加的市場需求。目前，人工栽培蛹蟲草已獲成功，并實現了規模化生產，我們可在一定程度上用人工栽培蛹蟲草代替冬蟲夏草入藥。

N6-(2-羥乙基)腺苷又名蟲草菌素，是天然的腺苷類似物，而腺苷很早就被認為是內源性的睡眠調節劑，20世紀50年代起就有報道腺苷對貓的催眠效應[6]。WANG等通過實驗證明N6-(2-羥乙基)腺苷（合成）在小鼠體內可引起移動性減少，具有顯著的鎮靜催眠效果[6]。蟲草多糖是蛹蟲草中另一種重要的活性物質，在蛹蟲草中多糖的含量為4%～10%[8]。其主要功能是增強免疫力，還具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、抗衰老等作用[9]，但其作用機理尚不明確。蛹蟲草多糖提取一般先用乙醚脫脂，再經熱水提取、乙醇沉淀得粗多糖。

我們選取蛹蟲草（干蠶蛹和大米生產）為原料，通過溶劑提取、色譜分離獲得蟲草多糖與N6-(2-羥乙基)腺苷，開展二者組合給藥對戊巴比妥鈉閾上劑量和閾下劑量致小鼠睡眠的影響，并探討組合用藥是否具有藥理毒性，以期開發一系列綠色、健康的具有預防和治療失眠功效的藥物，為因失眠而影響生活的大眾解決睡眠健康問題。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑

蛹蟲草，購自正源堂（天津）生物科技有限公司，組合樣品為[N6-(2-羥乙基)腺苷55%、蟲草多糖45%，20140514]、棗仁安神膠囊（貴州同濟堂制藥有限公司，121104）、艾司唑侖片（天津太平洋制藥有限公司，130503）、戊巴比妥鈉（Sigma公司分裝）、色譜甲醇（天津市康科德科技有限公司）、95%乙醇。

1.2 試驗動物

KM小鼠18～25 g，雌雄各半，動物許可證號：SCXK（京）2012-0001，合格證號：11400700020779。動物來源于中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，SCXK（軍）2012-0004，飼料來源于中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，SCXK（軍）2007-001。飼養環境：普通級，室溫，常規飼喂。

1.3 儀器與設備

DAC150（150×250 mm，C18，10 μm）（江蘇漢邦科技有限公司）、Xcharge C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，100 ?）（華譜新創科技有限公司）、注射器（上海治宇醫療器械有限公司）、秒表、EL電子天平（常州天之平儀器設備有限公司）。

2 實驗設計

2.1 蟲草多糖的制備與總糖、蛋白質含量測定

2.1.1 蟲草多糖的制備

稱取蛹蟲草子實體進行超低溫粉碎得到超微粉，利用超純水進行3次加熱提取，每次3 h，合并提取液后濃縮得到水提取濃縮液。將上述水提取濃縮液用適量水分散，將其加入體積分數為95%的乙醇并迅速攪拌，充分混勻，將乙醇濃度調至80%，4 ℃冰箱中冷藏靜置沉淀過夜，離心，獲得上清液和沉淀，上清液備用，沉淀即為蟲草多糖。

2.1.2 總糖含量的測定[10]

（1）葡萄糖標準曲線的測定。分別吸取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的葡萄糖標準溶液至10 mL具塞試管，用蒸餾水補至1.0 mL，向試液中加入1.0 mL 5%苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL濃硫酸，添加時需與液面垂直，勿接觸試管壁，以便于反應液充分混合，反應液靜止放置10 min。使用渦旋振蕩器使反應液混合，然后將試管放置于30 ℃水浴鍋中反應20 min。取適量反應液在490 nm處測吸光度。

（2）測定多糖含量。將干燥至恒重的粗多糖50 mg，用減量法稱取后放置在100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，獲得試樣測試液。準確吸取試樣測試液0.2 mL于10 mL具塞試管中，用蒸餾水補至1.0 mL，按步驟2.1.2（1）操作，以空白溶液調零，測得蟲草多糖吸光度，以標準曲線計算總糖含量。

2.1.3 蛋白含量的測定[11]

（1）牛血清白蛋白標準曲線制備。精確量取0.5 mg/mL牛血清白蛋白0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL分別置于試管中，補蒸餾水至0.5 mL，再依次加入0.1 mg/mL 的考馬斯亮藍染料3 mL，搖勻。室溫下放置15 min，在595 nm波長處測定吸光度。

（2）樣品蛋白含量測定。將干燥至恒重的粗多糖500 mg，用減量法稱取后放置在50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，獲得試樣測試液。取樣品溶液0.5 mL于試管中，按標準曲線方法操作，然后測定595 nm波長處的吸光度，并以標準曲線計算樣品中蛋白質的量。

2.2 N6-(2-羥乙基)腺苷制備與純化[12 ]

將步驟2.1.1中所述的上清液濃縮干燥獲得粗N6-(2-羥乙基)腺苷。稱取一定量粗N6-(2-羥乙基)腺苷，加入15%甲醇/水溶解至濃度為200 mg/mL，微孔濾膜過濾，用高效液相色譜法進行分離純化，色譜柱為DAC150（150 mm×250 mm，C18，10 μm），洗脫方式為15%甲醇/水等度洗脫70 min，檢測波長為260 nm，收集52～67 min餾分。

取提純后N6-(2-羥乙基)腺苷粉末用100%甲醇溶解至濃度為100 mg/mL，微孔濾膜濾過，用高效液相色譜純度驗證，色譜柱為C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），洗脫方式為25%甲醇/水等度洗脫30 min，流速0.3 mL/min，檢測波長為260 nm。

2.3 N6-(2-羥乙基)腺苷與蟲草多糖組合用藥的小鼠睡眠表現

2.3.1 動物分組及給藥方法

小鼠（雌雄各半）隨機分為棗仁安神膠囊組、艾司唑侖片組、空白組和N6-(2-羥乙基)腺苷與蟲草多糖組合用藥低、中、高劑量組，共6個組，每組12只。棗仁安神膠囊組給予棗仁安神膠囊灌胃劑292.5 mg/kg?d灌胃，艾司唑侖片組給予艾司唑侖片灌胃劑0.029 mg/kg?d灌胃，空白組在相同給藥時間及給藥時長灌胃給予生理鹽水，N6-(2-羥乙基)腺苷與蟲草多糖組合用藥低、中、高劑量組分別給予組合樣品14.6 mg/kg?d、29.1 mg?/kg?d、58.2 mg/kg?d，連續灌胃15天。

2.3.2 實驗方法及觀察指標

（1）腺苷與蟲草多糖組合用藥對小鼠自發活動（曠野法）的效應。動物末次給藥1 h后，采用曠野法將小鼠放入100 cm×100 cm×40 cm無蓋箱，箱底畫有10 cm×10 cm的格子，待小鼠適應5 min后，記數2 min內小鼠爬過的格子數，連續2次，取平均值進行結果統計分析。

（2）腺苷與蟲草多糖組合用藥對閾上劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時間的影響。動物末次給予棗仁安神膠囊、艾司唑侖及不同劑量腺苷與蟲草多糖組合用藥1 h后，各組動物腹腔注射戊巴比妥鈉閾上催眠劑量（使100%動物入睡，但又不使睡眠時間過長的戊巴比妥鈉腹腔注射劑量），以翻正反射消失為指標，觀察腺苷與蟲草多糖組合用藥能否延長閾上劑量戊巴比妥鈉使小白鼠翻正反射消失的時間。記錄入睡潛伏期（腹腔注射至翻正反射消失的時間）和睡眠持續時間（翻正反射消失至恢復的時間）。

（3）腺苷與蟲草多糖組合用藥對閾下劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠發生率的影響。動物末次給藥1 h后，每組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉閾下催眠劑量（使90%～100%的動物翻正反射不消失的最大劑量），記錄30 min內入睡動物數（翻正反射消失達1 min以上者），計算入睡動物發生率。

2.3.3 N6-(2-羥乙基)腺苷與蟲草多糖組合用藥急性毒性考察

小鼠（雌雄各半）空腹12 h后，隨機分為腺苷與蟲草多糖組合用藥低、中、高劑量組和空白組，組合用藥組分別一次灌胃給藥1.25 g/kg、2.5 g/kg、5 g/kg。每日記錄各組小鼠體重與飲食量變化、觀察是否有死亡現象與中毒反應的發生。

3 實驗結果

3.1 蟲草多糖的含量

如圖1，以葡萄糖質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，制定標準曲線，制得回歸方程：y=0.0097x + 0.0023，R2=0.9995。從表1可知，蟲草多糖含量為25.67%。

圖1 葡萄糖標準曲線

3.2 粗多糖中的蛋白含量

如圖2，以A595nm值為橫坐標，牛血清蛋白濃度（mg/mL）為縱坐標，做標準曲線，制得回歸方程：y=4.4543x+0.8883，R2=0.9915。測得樣品蛋白濃度為0.142 mg/mL，蛋白含量為1.42%。

表1 蟲草多糖含量測定結果

圖2 考馬斯亮藍標準曲線

3.3 N6-(2-羥乙基)腺苷HPLC

經過HPLC測樣，得到其色譜圖（圖3）。通過計算，其N6-(2-羥乙基)腺苷純度為98.878%。

圖3 N6-(2-羥乙基)腺苷HPLC色譜圖

3.4 N6-(2-羥乙基)腺苷與蟲草多糖組合用藥的小鼠睡眠表現

給予連續灌胃15天后，組合用藥高劑量組（58.2 mg/kg）與空白組比較，小鼠在一定時間內爬過格子數有極顯著差異（<0.01），與中藥對照組（棗仁安神膠囊組）比較無顯著差異，其余各組與空白組比較有顯著差異（<0.05）（圖4a）；在睡眠持續時間方面，組合用藥給予劑量為58.2 mg/kg時，與空白組比較有極顯著差異（<0.01），與中藥對照組（棗仁安神膠囊組）比較無顯著差異（圖4b）；在閾下劑量入睡率方面，各組入睡率均高于空白組，且當劑量為58.2 mg/g時，其入睡率與中藥對照組（棗仁安神膠囊組）相當，組合樣品在給予劑量為14.6 g/kg時，其入睡率與西藥對照組（艾司唑侖組）相當（圖4c），且入睡率與給藥劑量呈劑量依賴性；在入睡潛伏時間方面，各給藥組與空白組比較均有極顯著差異（<0.01），直觀觀測組合樣品各組別藥效略差于中藥對照組（棗仁安神膠囊組）及西藥對照組（艾司唑侖片組）（圖4d）。

3.5 N6-(2-羥乙基)腺苷與蟲草多糖組合用藥的小鼠體重與急性毒性表現

一次給藥15天后，組合樣品在1.25～5.0 g/kg范圍內，減緩了小鼠體重的增長（圖5a），其影響程度與給藥劑量呈正相關關系；組合樣品也影響小鼠的每日攝食量（圖5b），其與給藥劑量也呈正相關關系，由此推測，組合樣品可能通過減少小鼠的攝食量而影響其體重增長。在給藥劑量1.25～5.0 g/kg范圍內，小鼠未出現死亡現象，存活率均為100%；但有不同程度的中毒可逆反應，如豎毛、困倦，涉及到自主神經系統及睡眠中樞系統，且中毒反應隨給藥量的減少發生率降低或持續時間縮短。小鼠解剖后機體各主要臟器無肉眼可見異常。

4 討 論

根據上述結果，我們認為N6-(2-羥乙基)腺苷與蟲草多糖組合用藥可減少機體的自主活動性，縮短入睡前時間。在給藥劑量為58.2 mg/kg時，N6-(2-羥乙基)腺苷與蟲草多糖組合用藥對小鼠入睡率和睡眠時間的效應顯著，可顯著延長睡眠時間和提高小鼠入睡率，改善睡眠質量。說明組合用藥催眠效果明顯，催眠作用與中藥對照組（棗仁安神膠囊組）相當，且入睡率與給藥劑量呈正相關性，組合用藥濃度越高，入睡率越高。急毒實驗結果，小鼠存活率為100%，未出現死亡現象，初步證明N6-(2-羥乙基)腺苷與蟲草多糖組合用藥的安全性。這為蟲草多糖進一步深入研究和推廣應用于治療失眠方面提供了科學依據。

a：每組小鼠的平均體重； b：每組小鼠的平均飲食量。

失眠是一種常見病、多發病。隨著現代社會生活節奏的加快，工作、學習壓力的增大，使失眠成為臨床常見病癥，不僅給患者的身心健康帶來影響，還會導致嚴重的社會問題。根據中醫理論，蛹蟲草可能通過補腎益精使精血充足而致養心安神，從而達到鎮靜催眠[13]。以本實驗室已有的實驗數據為基礎，通過閱讀大量相關文獻，建立了一種高效、簡便易行、綠色、便于工業化的蛹蟲草N6-(2-羥乙基)腺苷提取分離工藝。將蟲草多糖與N6-(2-羥乙基)腺苷組合用作抗失眠藥物，與單獨N6-(2-羥乙基)腺苷給藥相比[14]，提高了小鼠入睡率。研究表明，N6-(2-羥乙基)-腺苷抗失眠作用機制可能與作用于腺苷A 2受體有關[15]。腺苷可作為一種睡眠因子，在睡眠-覺醒調控中發揮重要作用[15]。

失眠作為中醫治療的優勢病種之一，選擇中醫藥治療越來越受到人們的重視和青睞。本研究從中醫組分中藥治療疾病思路出發，采用活性組分組合給藥的方式，考察其對失眠的效應，這是本研究的創新點。實驗結果為后期建立特定的失眠癥狀模型供進一步研究打下良好基礎。

[1] 翟艷. 失眠的藥物治療[J]. 淮海醫藥, 2016(1): 126-128.

[2] Pearson N J, Johnson L L, Nahin R L. Insomnia, trouble sleeping, and complementary and alternative medicine: analysis of the 2002 national health interview survey data[J]. Arch Intern Med, 2006, 166(16): 1775-1782.

[3] 丁鈮, 滕晶. 中醫“五神”理論在身心類疾病中的應用探析[J]. 成都中醫藥大學學報, 2012, 35(4): 82.

[4] 張園. 抑郁性失眠的藥物治療進展[J]. 重慶醫學, 2009, 38(10): 1179-1180.

[5] Zhu L N, Xue J J, Liu Y F, et al. Isolation and purification of N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine from cordyceps militaris Fruit Bodies and Inhibitory Effect on K562 Tumor Cell Proliferation[J]. Acta Edulis Fungi, 2013, 20(1): 62- 65.

[6] 孫月, 薛陽, 王琦. 野生蛹蟲草與組培蛹蟲草子實體的成分測定與分析[J]. 遼寧師專學報(自然科學版), 1999(1): 3-5.

[7] Wang D M, Liu X H, Guo H, et al. Design, synthesis and biological activity evaluation of adenosine analogues[J]. Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48(6): 881-886.

[8] 廖春麗, 方改霞, 王蓮哲, 等. 蛹蟲草主要有效成分分析[J]. 安徽農業科學, 2008, 36(12): 5050-5052.

[9] 占鵬飛, 徐森華, 施國方, 等. 蛹蟲草多糖提取及其免疫功能研究進展[J]. 蠶桑通報, 2014(2): 10-14.

[10] 崔立勛, 張愛華, 孫守英. 蟲草多糖的分離純化及含量測定[J]. 中國醫藥科學, 2012, 2(21): 95-96.

[11] 李超. 承德及周邊地區野生菌采集鑒定及生物學活性分析[D]. 邯鄲: 河北工程大學, 2019.

[12] 陳玉皎, 孫嘉辰, 張曉倩, 等. 蛹蟲草中N_6-(2-羥乙基)腺苷的提取分離及對小鼠睡眠的影響[J]. 中國新藥雜志, 2015(7): 99-103.

[13] 黃海杰, 李宜芳. 治療失眠經驗淺析[J]. 實用中醫藥雜志, 2013, 29(10): 858.

[14] 季文博, 高家榮, 姜輝, 等. 失眠的中醫病機及治療策略[J]. 中醫藥臨床雜志, 2012, 24(8): 804-806.

[15] Michael J. Durcan, Philip F. Morgan. Evidence for adenosine A2 receptor involvement in the hypomobility effects of adenosine analogues in mice[J]. European Journal of Pharmacology, 1989, 168(3): 285-290.

[16] 周嬌嬌, 陳旭, 王剛. 作用于腺苷受體改善失眠藥物的研究進展[J]. 中國醫刊, 2019, 54(1): 24-26.

Effects of N6-(2-hydroxyethyl) adenosine combined with polysaccharide fromon the sleep of mice

Nie Kaimei1Du Simiao1Chen Mei1Li Chengxi1Wu Yuqian1Chen Yujiao1,2Cao Jun1

（1. Guizhou Gui’an Academy of Precision Medicine Co. Ltd., Gui 'an,Guizhou, 561113, China; 2. Bioengineering Clllege of Chongqing University, Key Laboratory of Biorheological Science and Technology Ministry of Education, Chongqing, 400044, China）

To develop healthy foods or medicines for the prevention and treatment of insomnia,was used as raw material to obtain polysaccharide and N6-(2-hydroxyethyl) adenosine, and the combination of 45% polysaccharide and 55% N6-(2-hydroxyethyl) adenosine is administered by spontaneous mice activity experiments, and the effects of combined administration on sedation and hypnosis in mice were observed through spontaneous activity experiments in mice and pentobarbital sodium sleep time experiments, and further carry out the acute toxicity experiments to preliminarily investigate the drug safety dose. The results showed that the administration of N6-(2-hydroxyethyl) adenosine and polysaccharide under the experimental conditions can improve the sleep quality of mice, and can improve the sleep rate compared with N6-(2-hydroxyethyl) adenosine alone.

N6-(2-hydroxyethyl) adenosine; polysaccharide; pharmacological action; sleep

R965.1，S567.3

A

2095-0934（2021）03-216-06

貴州省科技支撐計劃項目（No.黔科合支撐[2017]2960）

聶開美（1992—），女，碩士，主要從事生物制藥研究。E-mail：nkm295827@126.com。

曹軍，男，研究員，主要從事中醫藥、基因測序、生物制藥等成果轉化工作。E-mail：htjingong@sina.cn。

陳玉皎，女，博士，主要從事中醫藥成果轉化、基因測序、生物制藥等研究工作。E-mail：chenyujiao623198@126.com。