香菇液體菌種培養基及搖瓶培養條件優化

謝 婷 何 娟 張順凱 焦海濤 邊銀丙 肖 揚*

香菇液體菌種培養基及搖瓶培養條件優化

謝 婷1何 娟1張順凱2焦海濤2邊銀丙1肖 揚1*

（1. 華中農業大學應用真菌研究所，武漢 430070；2. 湖北森源生態股份有限公司，湖北 宜昌 444200）

建立液體菌種優質高效生產技術體系是香菇工廠化生產的重要保障。以香菇‘森源16’為試驗菌株，選擇菌絲生物量、菌絲球密度和直徑為主要評價指標，采用單因素和正交試驗L9(34)優化香菇搖瓶液體發酵工藝。結果：棉稈粉為最佳碳源，麩皮為最佳氮源；優化培養基配方為葡萄糖3 g/100mL，棉稈粉1.5 g/100mL，木屑粉1.5 g/100mL，麩皮0.6 g/100mL，KH2PO40.1 g/100mL，MgSO4·7H2O 0.05 g/100mL；最優搖瓶發酵條件為裝液量100 mL/250mL，搖床轉速170 r/min，初始pH 5.5，羧甲基纖維素鈉0.20 g/100mL，漆酶0.05 g/100mL。

香菇；液體菌種；培養基優化；搖瓶發酵；條件優化

香菇（）營養豐富，味道鮮美，被譽為“山珍之上品”，且具有抗病毒、免疫調節、健胃、助消化、抗炎癥、抗菌和抗腫瘤等活性[1, 2]。2018年我國香菇產量為1 043.12萬噸，居世界首位[3]。傳統的生產模式已無法滿足香菇產業快速發展的要求[4]，香菇生長周期較長，菌齡不一致，生產成本高，生產過程易染菌、出菇期長且整齊度低、投入勞動強度大等缺點，成為制約產業規模化、周年化和機械化發展的主要因素[5]。菌種生產是食用菌生產的第一道工序，菌種的優劣關系到產業的成敗[6]。成熟的液體菌種生產技術是食用菌產業工廠化、周年化和規?；a的關鍵。目前液體菌種越來越受到食用菌生產企業的青睞，已成為食用菌制種產業的發展趨勢[6-8]。香菇液體菌種與固體菌種相比具有以下優點：一是生產工藝簡便；二是菌種純度高，菌齡一致；三是污染率較低；四是標準化程度和管理效率高，能進行周年工廠化生產；五是成本降低，利潤提高[9]。

成熟的液體菌種生產技術是食用菌產業工廠化、周年化和規?；a的關鍵。香菇液體菌種的研究在20世紀80年代就有報道，但至今仍未應用于大規模栽培。液體培養發酵工藝是獲取優質香菇液體菌種的關鍵，培養基組成成分、搖床轉速、培養溫度和通氣量等則是其中重要的影響因素[9]。香菇液體培養基組分為氮源、碳源、微量元素、無機鹽和生長因子等[10]。本研究對‘森源16’菌株的液體培養基配方及培養條件進行優化，以促成香菇液體菌種的規?；a與應用。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌株‘森源16’由湖北森源生態科技股份有限公司提供。

1.2 培養基配方

母種培養基：PDA培養基。對照液體培養基（CK）：葡萄糖2 g/100mL，玉米粉0.3 g/100mL，麩皮0.4 g/100mL，豆粕0.3 g/100mL，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，pH自然。

選取新鮮無霉變的木屑粉、豆粕、麩皮、玉米和棉稈等天然基質置于電熱恒溫烘箱中烘干，使用粉碎機粉碎后過120目篩（孔徑0.125 mm），按配方稱取相應重量至對應的對照液體培養基或優化培養基中。

1.3 試驗方法

1.3.1 液體菌種的制備

將大小約0.5 cm2的菌塊接入裝有100 mL培養基的250 mL三角瓶中，每瓶接5塊，接種完畢后置于恒溫搖床中，在170 r/min、25 ℃條件下震蕩培養10天。

1.3.2 培養基配方的優化

（1）單因素篩選。培養基碳源選擇葡萄糖、玉米芯粉、棉稈粉、木屑粉，氮源為豆粕粉和麩皮，試驗共設計9個配方（表1）。將配方1作為氮源與碳源試驗的對照組；配方1、2和3分別以葡萄糖、棉稈粉、玉米芯粉作為單一碳源；配方8和9分別以麩皮和豆粕作單一氮源，比較兩者之間的差異。每處理3次重復。

表1 液體菌種培養基碳氮源的單因素配方(g/100mL)

以菌絲生物量（以菌絲干重計）、菌絲球直徑和密度為評價指標，確定適宜的碳源和氮源組成。菌絲生物量、密度和直徑測量方法參考實驗室前期工作[11]。所有處理均添加0.05%的MgSO4和0.1%的KH2PO4；搖瓶培養條件為：150 r/min，25 ℃連續培養10天。

（2）正交試驗篩選最佳配方。通過單因素篩選出各碳源和氮源的濃度（表2）。進一步應用SPSS22.0軟件設計L9(34)正交試驗，以菌絲生物量為衡量指標，確定液體菌種發酵的最優配方（表3），每組試驗重復3次。

表2 液體菌種培養基正交優化試驗的碳氮源水平

表3 液體菌種培養基配方正交優化試驗設計

1.3.3 搖瓶發酵工藝的優化

（1）使用優化的培養基配方對發酵工藝進行單因素篩選。各因素分別為：①羧甲基纖維素鈉，分別設置0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/100mL等5個濃度，在25 ℃，150 r/min，裝液量100 mL，pH自然條件下培養10天。②外源添加漆酶，分別設置0、0.01、0.03、0.05、0.07 g/100mL等5個濃度，在45 ℃下處理24 h。在25 ℃，150 r/min，裝液量100 mL，pH自然條件下培養10天。③搖瓶裝液量，設置60、80、100、120、140 mL等5 檔，在25 ℃，150 r/min，pH自然條件下分別培養10天。④培養基初始pH，分別調節至4、5、6、7、8和pH自然，在25 ℃，150 r/min，裝液量100 mL條件下培養10天。⑤搖瓶轉速，設置140、150、160、170、180 r/min等5個水平，在25 ℃，裝液量100 mL，pH自然條件下培養10天。以上參數的最優值，均通過測定菌絲生物量、菌絲球密度和直徑加以判定。

（2）通過正交試驗確定最佳發酵工藝。單因素試驗確定的各參數水平如表4所示。進一步應用SPSS 22.0軟件設計L9(34)正交試驗，以菌絲生物量為主要衡量指標，確定香菇液體菌種發酵的最優配方（表5），每組試驗重復3次。

表4 液體菌種發酵工藝正交優化試驗的因素水平

表5 液體菌種培養基配方正交優化試驗設計

2 結果與分析

2.1 不同碳、氮源與菌絲生長的關系

由圖1-A，B，C可知，配方2的菌絲生物量最大，配方4的菌絲球密度最大、直徑最小，說明棉稈粉與香菇的菌絲體生物量、菌絲球的密度和直徑有密切關系。前期實驗室研究結果表明，添加少量的木屑粉可以促進香菇菌絲生長[11]。因此選擇棉稈粉、木屑粉和葡萄糖作為最佳碳源應用。

不同氮源的菌絲體生物量差異不顯著（圖1-D）。以麩皮為氮源時，菌絲球的密度和直徑顯著高于豆粕（圖1-E，F），且其懸浮性好。綜合比較3個指標結果，選擇麩皮作為培養基氮源組分。

2.2 培養基正交優化試驗

根據單因素試驗得到的合適碳、氮源，用L9(34)型正交試驗表設計正交試驗，對培養基進行優化的結果（表6），極差最大的是因素B，然后依次為因素C、A和D。說明棉稈粉是對香菇液體發酵菌絲體干重影響最大的培養基組分，其次是木屑粉、葡萄糖和麩皮。極差分析結果表明，最優培養基配方為A3B3C3D2，即葡萄糖3 g/100mL，棉稈粉1.5 g/100mL，木屑粉1.5 g/100mL，豆粕0.6 g/100mL。葡萄糖、棉稈粉、木屑粉和麩皮與菌絲體干重的相關性均達到顯著水平（<0.05）。

由于極差分析得到的最優配方A3B3C3D2，并未出現在正交試驗表中，對該配方進行試驗驗證。按此配方培養10天后，測得菌絲體干重為1.165 g/100mL，高于正交表中的所有處理。

2.3 不同培養條件對菌絲生長的影響

2.3.1 羧甲基纖維素鈉濃度

粘度影響發酵過程中的溶氧濃度，同時也影響攪拌對菌絲機械剪切的作用。調節液體發酵環境的粘度，能調節菌球的大小和數量，從而制備出適合生產的最佳液體菌種[11]。從圖2-A，B，C可以看出，隨著羧甲基纖維素鈉濃度的增加，各配方的菌絲體生物量和菌絲球直徑都沒有顯著差異；菌絲球密度則呈先增高后降低趨勢，其中羧甲基纖維素鈉濃度為0.2 g/100mL時，菌絲球密度最大。該濃度下菌絲體生物量也較大，而菌絲球直徑小，因此可選其為最佳濃度。

表6 液體菌種培養基優化正交試驗結果

注：A為葡萄糖，B為棉稈粉，C為木屑粉，D為麩皮，Ki為各因素同一水平試驗指標的平均數。R為各因素的極差。

A～C：碳源篩選；D～F：氮源篩選。培養基編號見表1。不同小寫字母表示處理間差異顯著（P＜0.05）。

2.3.2 漆酶濃度

由圖2-D、E、F可知，隨著漆酶添加量的增加，菌絲體生物量逐漸增大，菌絲球密度和直徑則呈先上升后下降。漆酶添加量≥0.05 g/100mL，菌絲體生物量與對照相比有顯著性差異。其中漆酶添加量為0.05 g/100mL時，菌絲體生物量達到最大，為1.0876 g/100mL，菌絲球密度也為最大，為113個/mL。故選擇漆酶濃度為0.05 g/100mL作為最優添加濃度。

2.3.3 裝液量

隨著裝液量的增加，菌絲體生物量整體呈顯著上升態勢，菌絲球直徑逐漸增大，而密度顯著降低（圖2-G、H、I）。兼顧菌絲體干重、菌絲球密度和直徑3個指標，選擇100 mL為最優裝液量。

2.3.4 搖瓶轉速

搖瓶轉速影響培養基內溶氧，轉速過高，產生的剪切力影響菌絲體生長；轉速過低，空氣與培養基氧氣交換不足，影響溶氧水平[9]。隨著轉速的提高，菌絲體生物量逐漸降低，菌絲球直徑逐漸減小，菌絲球密度顯著增加（圖2-J、K、L）。說明轉速越大，液體培養基的溶氧量越大，菌絲所受的剪切力也越大。綜合菌絲生物量、菌絲球密度和直徑3個指標，選擇170 r/min為最佳轉速。

2.3.5 初始pH

pH對菌絲體生長和代謝產物生成有重要的作用[12]。隨著初始pH升高，菌絲體生物量先升高后降低，在pH為6時，達到最大值，為1.274 g/100 mL，菌絲球密度也最大，達171個/mL；菌絲球直徑則較?。▓D2-M、N、O）。故篩選出最佳pH為6.0。

2.3.6 發酵工藝正交優化

根據單因素試驗篩選得到的合適發酵工藝及相對應的濃度和條件，用L9(34)型正交試驗表設計正交試驗，對發酵工藝進行優化。從表7可以看出，極差最大的因素為B，其次分別為D、C、A。可見，對香菇液體發酵菌絲生物量影響最大的因素是外源添加漆酶，其次為初始pH、搖瓶轉速和增稠劑羧甲基纖維素鈉。極差分析結果，最優的發酵工藝為A3B2C1D1，即羧甲基纖維素鈉0.25 g/100mL，漆酶0.05 g/100mL，轉速170 r/min，pH 5.5。方差分析結果，外源添加漆酶濃度與菌絲體生物量之間的相關性達顯著水平（<0.05），而其他3項發酵條件對菌絲體干重的影響均未達到顯著水準。

由于得到的最優發酵條件A3B2C1D1，依然沒有出現在正交試驗表中，所以對該發酵條件進行驗證試驗，測得培養第10天的菌絲干重為0.853 g/100mL，高于正交表中的所有處理。

3 討 論

3.1 香菇液體菌種培養基配方的優化

培養基配方直接影響菌種質量，它既要提供微生物生長繁殖所需的營養物質，又要防止營養過剩、滲透壓過高而抑制菌體的生長。本實驗室前期研究發現，香菇菌絲在棉稈替代部分木屑的栽培料中生長較快，且出菇周期明顯縮短、出菇潮次集中[13]。在液體配方中添加部分木屑粉可以促進香菇菌絲的生長[11]，本研究首次引進了棉稈粉、玉米芯粉等栽培基質作為香菇液體培養基的碳源，以期獲得既能在液體培養中快速生長又能在栽培料中迅速定植的液體菌種。林剛等[14]對黃孢原毛平革菌（）的液體培養配方進行優化發現，添加木材浸出液的菌絲球產量是未添加浸出液的5倍，且不易感染雜菌；在生長初期產量增加不明顯，隨著培養時間的增加，菌絲球產量差別加大，因此，木材浸出液對菌絲球的生長具有刺激作用。對秀珍菇、平菇和香菇的培養基優化試驗發現，在純液體培養基中加入適量的固體成分可以完善營養成分，并且可以給菌種的菌球形成提供“寄生核”，對菌絲球的形成與發育有明顯的促進作用[15]。

目前在液體培養基中加入棉稈粉的研究尚未報道，因此，棉稈粉對香菇菌絲的作用還需進一步研究。香菇對小分子的有機碳源利用效果很好，本研究中優化配方的葡萄糖含量為3%。溶液中的葡萄糖含量適當降低，不僅能節約成本，溶液中的滲透壓也能相應減小。香菇液體培養基的配方優化試驗顯示，在培養基中加入2%葡萄糖、4%木屑和4%黃豆粉，香菇菌絲的產量最高[16]；也有顯示，添加2%麩皮和1%酵母粉時香菇菌絲生物量較[17]高。郭興等[18]優化元蘑液體培養基，發現酵母膏比蛋白胨、尿素、硫酸銨等氮源更好。本研究只使用了一種氮源，氮源的多樣性對香菇菌絲的生長是否存在交互作用，還需作進一步的研究。

A～C：羧甲基纖維素鈉濃度篩選；D～F：漆酶濃度篩選；G～I：裝液量篩選；J～L：搖瓶轉速篩選；M～O：初始pH篩選。培養基編號如表1所示。不同小寫字母表示處理間差異顯著（P＜0.05）。

表7 香菇液體菌種發酵工藝優化正交試驗結果

注：A為羧甲基纖維素鈉，B為漆酶，C為轉速，D為pH，Ki為各因素同一水平試驗指標的平均數。R為各因素的極差。

3.2 香菇液體菌種發酵工藝參數的優化

前人對于香菇液體菌種發酵工藝的研究較少，許多培養參數沒有系統優化。本研究優化了初始pH、搖床轉速、搖瓶裝液量、培養基的粘度（增稠劑）、外源添加漆酶濃度等參數，選取菌絲生物量、菌絲球直徑和密度3個指標，對其進行單因素篩選。

香菇為好氣性菌類，想要使菌絲又快又好地生長，需要在培養時給予足夠的氧氣。朱家騮等[19]對金針菇液體菌種的培養條件進行研究，發現在250 mL三角瓶中，裝液量在50～100 mL以內，菌絲球干重增加，而裝液量在100～150 mL之間，菌絲生物量則開始降低。這與本研究結果一致。徐思煒等[20]發現裝液量和轉速對香菇菌絲生長的影響較大，其中最優轉速為180 r/min，最優裝液量為100 mL/250mL。本研究得到的最優轉速為170 r/min。搖床轉速越快，培養液中的溶氧量越大，剪切力也隨之增加。因此，適當的轉速會促進香菇菌絲的生長。培養液的粘度對溶氧量也有較大的影響，在培養液中加入增稠劑可以增加培養液的濃度，增大剪切力。趙萍[21]對靈芝深層發酵過程中的發酵液粘度研究發現，增稠劑濃度為0.15%時，菌絲球密度大、重量較大且菌絲體大小均勻。本研究中添加0.25%的羧甲基纖維素鈉，讓香菇菌絲在適當的粘度下快速生長。

pH影響酶的活性及細胞膜活性，從而影響代謝。胡雯[22]研究發現，初始pH為5.5，香菇菌絲體生物量及胞外多糖產量最高，與本研究選出的最適初始pH相一致。一般木腐菌較喜歡在偏酸的環境中生長，且液體培養過程中培養基初始pH都會比終止pH高。原因是高溫滅菌時pH會下降，菌絲在分解基質的過程中分泌有機酸也會導致pH降低。漆酶不僅分布于動、植物體內，也存在于多種真菌中參與生物化學反應，具有重要生理功能。漆酶參與木質素的降解，為菌體的生長發育提供營養。本研究首次在液體培養基中添加漆酶，發現其能顯著提高香菇菌絲生物量。

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Optimization of liquid spawn media and shake flask culture conditions of

Xie Ting1He Juan1Zhang ShunKai2Jiao Haitao2Bian Yinbing1Xiao Yang1*

(1. Institute of Applied Mycology,Huazhong Agricultural University,Wuhan, Hubei 430070, China; 2. Hubei Senyuan Ecological Co., Ltd., Yichang, Hubei 444200, China)

The establishment of a high-quality and high-efficiency production technology system for liquid spawn is an important guarantee for the factory production ofs. In this study,Senyuan No.16 was used as the test strain, and the mycelial biomass, mycelial ball density and diameter were used as the main evaluation indicators. Single factor test and orthogonal test L9(34) were used to optimize the liquid culture process ofin shaking flasks. Results showed that cotton stalk powder is the best carbon source and wheat bran is the best nitrogen source. The optimized medium formula is glucose 3 g/100mL, cotton stalk powder 1.5 g/100mL, wood chip powder 1.5 g/100mL, wheat bran 0.6 g/100mL, KH2PO40.1 g/100mL and MgSO4· 7H2O 0.05 g/100mL. The optimal culture conditions for shake flasks are 100 mL/250 mL of liquid volume, 170 r/min of shaker speed, initial pH of 5.5, sodium carboxymethyl cellulose 0.25 g/100mL, laccase 0.05 g/100mL.

s; liquid spawn; medium optimization; shake flask culture

S646

B

2095-0934（2021）03-242-08

湖北省技術創新專項重大項目（2018ABA095）

謝婷（1995—），碩士，主要從事食用菌栽培方面的研究。

肖揚（1979—），副教授，主要從事應用真菌生物技術和食用菌栽培研究工作。E-mail：xiaoyang@mail.hzau.edu.cn。