結直腸癌患者腫瘤出芽情況與臨床病理特征、程序性死亡受體1及程序性死亡配體1表達相關性研究

趙英旋，白玉勤

(1.錦州醫科大學，遼寧 錦州 121001；2.赤峰學院附屬醫院普外科，內蒙古 赤峰 024000；3.赤峰市腫瘤醫院病理科，內蒙古 赤峰 024000)

結直腸癌(Carcinoma of colon and rectum，CRC)是消化道常見的惡性腫瘤，表現為便血及腹痛等癥狀[1]。近年來，CRC發病率和死亡率逐漸呈上升趨勢。據統計，CRC在全世界男性發病率中居第3位，病死率第4位；女性發病率居第2位，病死率居第3位；大多數患者處于中晚期，占所有CRC的50%[2]。歐洲醫學腫瘤學會(ESMO)提出，腫瘤出芽是早期CRC的潛在預后因素，其是由一個未分化的腫瘤細胞或4個細胞組成的小的局灶性腫瘤細胞群，存在于腫瘤浸潤的前緣，CRC中腫瘤出芽與微衛星不穩定性、細胞凋亡、腫瘤間質、缺氧和血管擴張、炎癥浸潤、微小RNAs(miRNAs) 、Ki-ras及KRAS/BRAF基因突變密切相關[3]。研究[4]發現，程序性死亡受體1(Programmed cell death-1，PD-1)是一種參與T細胞凋亡的跨膜受體，其與程序性死亡配體1(Programmed cell death-ligand 1，PD-L1)和PD-L2的相互作用會抑制T細胞的增殖。當正常機體感染病毒時，細胞內PD-L1和PD-L2蛋白的表達增加，與T細胞表面的 PD-1 受體相互作用，從而抑制T細胞的活化和增殖，降低殺傷腫瘤能力[5]?；诖?，本研究選取180例手術切除的CRC石蠟標本，探討CRC患者腫瘤出芽與臨床病理特征及PD-1/PD-L1的關系，以期為CRC診治提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2014年1月至2015年12月行根治術治療的180例CRC患者的臨床資料。其中，男性65例，女性115例；年齡30～75歲，平均(57.26±7.18)歲；腫瘤直徑1.5～10 cm，平均(4.51±0.30)cm。病例納入標準：①均符合CRC診斷，并經病理學確診[6]；②年齡30～75歲；③臨床資料及影像學資料完整；④術前未接受化學藥物治療、局部放射治療或其他抗腫瘤治療；⑤無惡性腫瘤病史。排除標準：①肝腎功能不全；②合并自其他惡性腫瘤；③術前發生全身轉移；④臨床資料不完整；⑤有家族遺傳史。

1.2 研究方法

1.2.1 腫瘤出芽計數：根據國際腫瘤出芽共識會議(ITBCC)上提出的腫瘤出芽標準化方法[7]進行判定，即在腫瘤浸潤前沿的間質中發現孤立的單個腫瘤細胞或2～4個小簇狀腫瘤細胞群為腫瘤出芽。低倍顯微鏡下觀察蘇木精-伊紅(HE)染色的腫瘤組織浸潤前沿，尋找腫瘤出芽最多的區域。如果不清楚哪個區域出芽最多，或者如果第一個區域的腫瘤芽數<15個，則應從多個區域評價腫瘤出芽，選擇出芽最多的區域進行分析。在總放大倍數為200倍的條件下，對面積為0.398 mm2的單個視野內的腫瘤芽數進行計數，然后將腫瘤芽數乘以1.97，得到的數為每0.785 mm2的腫瘤芽數，在光鏡下觀察到CRC中沒有出芽、低度出芽(<10個/高倍視野)和高度出芽(≥10個/高倍視野)(×20視野，0.785 mm2區域)。

1.2.2 標本制備和石蠟切片HE染色：離體的黏膜薄切和根治CRC組織標本快速在10%中性甲醛溶液中進行浸泡固定，采取組織梯度酒精脫水、透明、浸蠟，然后石蠟包埋。石蠟切片厚度為3 μm，于65 ℃溫度下烘烤2～5 h后浸泡于二甲苯溶液中脫蠟，室溫下梯度酒精脫苯及水化，酒精濃度依次為100%、95%、90%、80%和70%。接著采用流水沖洗3～5 min；蘇木素溶液染色2 min，流水沖洗 3 min；用1%鹽酸酒精溶液再浸泡1 min 后同樣采用流水沖洗3 min；再用伊紅溶液染色3～5 min，流水沖洗3 min；梯度酒精再脫水，酒精濃度依次為70%、80%、90%、95%和100%。3次二甲苯透明后采用中性樹膠封片，于放大倍數下觀察切片并記錄[8-9]。

1.2.3 免疫組織化學染色：采用羅氏機器自動化方法。連續石蠟切片厚度為3 μm。取CRC組織石蠟切片，經烤片、脫蠟、水化、抗原修復等過程，加入體積分數為3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶后，加入一抗 anti-PD-L1和PD-1(克隆號為MX033)，4 ℃冰箱過夜(12 h)，PBS清洗，先后加入羊抗鼠或兔IgG(二抗)室溫孵育1 h，DAB染色，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片[10-11]。

1.2.4 判定標準[12]：PD-L1和PD-1以細胞質或胞膜出現黃至棕褐色顆粒為陽性。PD-L1以陽性腫瘤細胞數≥1%為陽性，<1%為陰性。PD-1表達于腫瘤間質浸潤的淋巴細胞，以≥5%為陽性，<5%為陰性。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件處理數據。計數資料用[例(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗。等級資料采用秩和檢驗。采用多因素Logistic回歸模型分析腫瘤出芽情況與臨床病理特征的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CRC患者腫瘤不出芽時PD-1和PD-L1蛋白表達情況 見圖1。CRC不出芽石蠟標本連續切片行HE染色及免疫組化PD-1、PD-L1蛋白染色，60例CRC患者顯微鏡下未見腫瘤出芽，且PD-1、PD-L1蛋白呈陰性表達。

注：A圖為HE染色(×40)；B、C圖為PD-1蛋白免疫組化染色(×40)

2.2 CRC患者腫瘤出芽時PD-1和PD-L1蛋白表達情況 見圖2。顯微鏡下，在腫瘤浸潤的前緣間質內可見多個芽孢，且由孤立單個細胞或2～4個癌細胞成團組成，其中50例低出芽(圖2A-D)，70例高出芽(圖2E-G)。芽孢內細胞質融合，呈嗜酸性，形狀不規則，染色較間質細胞深，部分可見核分裂像。腫瘤細胞PD-1、PD-L1蛋白不著色或著色<1%。PD-1表達于腫瘤間質及淋巴細胞，局灶區陽性細胞數<5%。因此，PD-1、PD-L1蛋白亦呈陰性表達。

注：A、E 圖為HE染色(×40)；B、F圖為HE染色(×400；)； C、G圖為PD-1蛋白免疫組化染色(×40)；D、H圖為PD-L1蛋白免疫組化染色(×40)

2.3 CRC患者腫瘤出芽與臨床病理特征單因素分析 見表1。CRC腫瘤低出芽和高出芽患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤組織學、腫瘤分化程度及腸壁環繞情況比較無統計學差異(均P>0.05)，但病理分期、腫瘤形態、腸壁浸潤深度及轉移情況比較差異具有統計學意義(均P<0.05)。

表1 CRC患者腫瘤出芽與臨床病理特征單因素分析[例(%)]

續 表

2.4 影響CRC腫瘤出芽臨床病理特征多因素分析 見表2。將表1中有統計學差異的因素設為自變量(病理分期Ⅲ期=1，Ⅱ期=0；腫瘤形態呈侵襲型=1，呈腫塊型和潰瘍型=0；腸壁肌層和漿膜層浸潤=1，黏膜層和漿膜外浸潤=0；有淋巴結轉移=1，無淋巴結轉移和遠處轉移=0)進行Logistic多因素回歸分析，結果顯示病理分期、腫瘤形態、腸壁浸潤深度及轉移情況為影響CRC腫瘤出芽的獨立危險因素(均P<0.05)。

表2 影響CRC腫瘤出芽臨床病理特征多因素分析

2.5 CRC腫瘤出芽與預后的關系 對低出芽和高出芽患者進行5年隨訪。至2021年1月，隨訪時間平均(30.28±4.05)個月。隨訪期間無失訪，低出芽CRC患者7例死亡，總生存率為86.00%(43/50)；高出芽CRC患者32例死亡，總生存率為54.29%(38/70)。高出芽CRC患者5年總生存率低于低出芽CRC患者(P<0.05)。

3 討 論

CRC患者惡性腫瘤特征為腫瘤細胞侵襲性生長和轉移。腫瘤侵襲性生長是腫瘤細胞進入周圍間質，而腫瘤出芽是腫瘤侵襲性生長的形態表達，其除與CRC淋巴結轉移、預后等相關外，還與微衛星不穩定性(MSI)、細胞凋亡、缺氧、炎細胞浸潤等密切相關[13-14]。UICC已經正式承認腫瘤出芽是CRC的獨立預后因素[15]。Pan等[16]發現，有淋巴結轉移和淋巴管浸潤的直腸癌患者，其腫瘤出芽的發生高于無淋巴結轉移的直腸腺癌患者。楊天寧等[17]發現，腫瘤出芽在CRC淋巴結轉移和淋巴管浸潤方面的發生率具有相關性。

PD-1及其配體PD-L1是免疫治療的重點。其中，PD-1正常表達在胸腺細胞上，誘導性表達于活化的T細胞、B細胞及自然殺傷細胞等，當抗原清除、免疫應答完成后T細胞PD-1表達減少。PD-1表達在T細胞上會誘導T細胞衰竭，因此PD-1屬于免疫抑制受體。PD-L1是PD-1主要配體，是負性免疫調節蛋白，表達于腫瘤細胞、巨噬細胞和T細胞等，可抑制T細胞活化，促進細胞凋亡，減弱免疫系統對腫瘤細胞的監視作用，從而使腫瘤細胞發生免疫逃逸。腫瘤發生時腫瘤微環境會誘導浸潤性T細胞高表達PD-1分子，進而激活腫瘤微環境中PD-1通路，且與PD-L1聯接后會抑制T細胞功能[18-19]。本研究結果顯示，腫瘤出芽率為66.67%(120/180)；CRC腫瘤不出芽區域和出芽區域腫瘤細胞PD-1和PD-L1蛋白不著色或<1%著色，PD-1表達于腫瘤間質浸潤的淋巴細胞及間質細胞，局灶陽性細胞數<5%，結果為陰性，證明了CRC腫瘤不出芽和腫瘤出芽與PD-1和PD-L1蛋白表達無顯著關系。另外，本研究發現低出芽和高出芽CRC患者病理分期、腫瘤形態、腸壁浸潤深度及轉移情況比較差異具有統計學意義，與陳艷昕等[20]報道一致，說明腫瘤出芽與病理分期、腫瘤形態、腸壁浸潤深度及轉移情況密切相關；同時Logistic多因素回歸分析結果顯示，病理分期、腫瘤形態、腸壁浸潤深度及轉移情況為影響CRC腫瘤出芽的獨立危險因素，進一步證實了腫瘤出芽與病理分期、腫瘤形態、腸壁浸潤深度及轉移情況的相關性，病理分期高、腫瘤呈侵襲型、腸壁肌層和漿膜層浸潤以及存在遠處轉移的CRC患者腫瘤出芽發生率更高。與其他研究不同的是，本研究進行5年隨訪后研究發現，高出芽CRC患者5年總生存率低于低出芽患者，由此可見高出芽CRC患者預后較差，進一步證實了腫瘤高出芽對CRC具有一定的預測價值。

綜上所述，腫瘤不出芽和出芽與PD-1、PD-L1蛋白表達無相關性。病理分期、腫瘤形態、腸壁浸潤深度及轉移情況等病理特征是影響CRC患者腫瘤出芽的危險因素，可為制定術后輔助治療方案和判斷預后提供指導。但本研究納入病例數較少，可能對結論有一定影響，后續將擴大樣本量進一步論證。