二甲雙胍通過抑制Wnt/β-catenin信號通路對胃癌干細胞增殖和凋亡的研究

王冬梅，馮永剛，姚鴻萍

(西安交通大學第一附屬醫院藥學部，陜西 西安 710061)

胃癌在全世界的患病及致死率較高，主要與患者術后腫瘤細胞發生轉移及再復發有關，因此尋找安全有效的藥物是目前臨床防治胃癌及改善其預后的研究焦點[1-3]。胃癌干細胞作為胃癌細胞抗化療、誘導腫瘤轉移復發的根源，因此抑制胃癌干細胞增殖及誘導其凋亡才是治療胃癌的關鍵[4]。Jung等[5]研究表明，人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)過表達可激活與胃癌干細胞相關的Wnt/β-catenin信號通路，進一步誘導胃癌細胞的侵襲及轉移，說明胃癌干細胞的增殖、轉移、凋亡等生物行為學機制與Wnt/β-catenin信號通路被激活密切相關。二甲雙胍是臨床上常用于治療糖尿病的一線藥物，具有防止肝臟糖異生、提高骨骼肌葡萄糖攝取率的作用[6-7]。研究[8-12]發現，二甲雙胍在抗腫瘤細胞及腫瘤干細胞活性上具有重要價值。然而，關于二甲雙胍通過作用Wnt/β-catenin信號通路來影響胃癌干細胞增殖、凋亡機制的研究鮮有報道。本研究對胃癌MKN-45細胞株分離培養并鑒定，并通過不同劑量二甲雙胍分別處理，探究胃癌干細胞的增殖、凋亡及Wnt/β-catenin信號通路相關基因表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞株MKN-45 由武漢普諾賽生命科技有限公司提供；二甲雙胍由美國Sigma-Aldrich公司提供；CCK-8試劑盒由日本Dojindo公司提供；RPMI-1640完全培養基、CD44+磁珠由北京諾為生物技術有限公司提供；兔抗CD44購自美國abcam公司；RNA提取試劑盒由Invitrogen公司提供；SYBR? Premix Ex TaqTM II試劑盒由寶生物工程有限公司提供；β-連環蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β) 以β-actin引物交由Takara公司設計；BCA試劑盒由AmyJet Scientific公司提供；性別決定區Y框蛋白2(sex-determining region Y-box protein 2，SOX2，兔抗)、八聚體結合轉錄因子4(octamer-binding transcription factor4，OCT4，兔抗)、同源域蛋白(nanog homeobox，nanog，兔抗)和磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH，兔抗)由Cell Signaling Technology公司提供；ImageJ2x軟件由National Institutes of Health公司提供；熒光顯微鏡由浙江湖州萊特科技有限公司提供(型號XSP-63X)；PCR引物及PrimeScript RT試劑盒由寶日醫生物技術公司提供；流式細胞儀由美國BD公司提供(型號FACSCalibur)。

1.2 方法

1.2.1 MKN-45細胞及其干細胞培養 將MKN-45細胞在含有10%胎牛血清RPMI-1640完全培養基中，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞貼壁后，取對數生長期MKN-45細胞胰酶消化，放于含無血清1640培養液(含有1%青霉素、20 μg/L堿性成纖維細胞生長因子、100 μg/L表皮細胞生長因子、1%N-2添加劑、2%B-27添加劑)的96孔超低吸附培養皿中培養，在倒置顯微鏡下定期觀察懸浮球體細胞成型情況。并按照1∶3進行傳代。

1.2.2 胃癌干細胞分選 取對數生長期MKN-45細胞，胰酶消化成單細胞懸液，細胞計數，細胞濃度1×107/mL，離心重懸，向其中加入20 μL CD44磁珠，4 ℃ 孵育15 min，沖洗離心取上清液，重懸后，將磁珠分選分離柱放置于磁珠分選器中，對從磁珠分選分離柱中流出的細胞(CD44-)進行收集，每次待柱內液體流盡時，予以緩沖液沖洗，收集總的流出液，將柱子卸下，與離心管相接，之后予以泵壓，分選洗液細胞即為CD44+細胞[13]。胃癌干細胞分選分選成功標準[13]：通過分選前、后MKN-45細胞中CD44+含量變化情況來判斷胃癌干細胞分選成功與否，具體方法如下：(1)免疫熒光法鑒定CD44+表達情況：取分選前及分選后MKN-45腫瘤細胞球，胰酶消化成單細胞懸液，種于6孔培養板(細胞濃度1×108/L)，培養于10%胎牛血清RPMI1640培養基中，12 h后將細胞取出，棄培養液，PBS漂洗，丙酮室溫放置10 min，PBS洗滌，用10%山羊血清于室溫封閉0.5 h，棄血清，向其中加入CD44抗體(稀釋1∶200)，4 ℃過夜孵育，滴加熒光標記的相應二抗，室溫避光孵育1 h，于熒光顯微鏡下拍照，圖片中綠色熒光顯示為含有CD44+的細胞。(2)為進一步對MKN-45腫瘤細胞球中CD44+含量進行定量分析，采用流式細胞術檢測分選前及分選后CD44+胃癌干細胞比例：取分選前及分選后MKN-45細胞，胰酶消化成單細胞懸液，離心棄去上清液，PBS洗滌，加入CD44+抗體，冰上孵育1 h，離心棄去上清液，PBS洗滌，離心后，流用含有1%BSA的PBS重懸，于400目濾網中將細胞懸液過濾，置入流式管中，通過流式細胞儀檢測分選前、后CD44+細胞所占比例，來判斷CD44+細胞分選成功與否。

1.2.3 胃癌干細胞的鑒定 通過檢測胃癌干細胞標記物SOX2、OCT4、Nanog表達情況進一步對1.2.2分選的MKN-45細胞干細胞特性進行鑒定。免疫印跡法鑒定腫瘤干細胞標記物(SOX2、OCT4、Nanog)的表達：提取懸浮MKN-45腫瘤細胞球和貼壁細胞中干細胞標記物SOX2、OCT4、Nanog的總蛋白。通過BCA試劑盒測定蛋白濃度。將提取的蛋白與上樣緩沖液混合，95 ℃煮10 min、離心，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜。室溫下5%脫脂乳在TBST中封閉1 h，滴加一抗(1∶1 000稀釋)SOX2、OCT4、Nanog和GAPDH 4 ℃孵育過夜，室溫下磷酸鹽緩沖液洗滌，加入相應的二抗37 ℃孵育l h，洗滌，化學發光試劑顯影，蛋白印記圖像用ImageJ2x軟件分析，蛋白水平通過灰度值/GAPDH條帶灰度值進行表示。

1.2.4 CCK-8檢測各組MKN-45干細胞增殖活力 取第3代MKN-45干細胞，予以PBS清洗，進行胰酶消化，制成單細胞懸液。計數后，以每孔1×105/L細胞濃度接種于96孔板中，在培養箱孵育24 h，換液，分別向其中加入3中濃度的二甲雙胍(0、1、5、10 mmol/L)溶液，培養24、48、72 h時，取出培養板，根據CCK8試劑盒說明書，加入10 μL CCK8繼續培養2 h，在490 nm處讀取吸光度值(OD)，制作增殖曲線圖。

1.2.5 流式細胞術檢測MKN-45干細胞凋亡情況 取第3代MKN-45干細胞，予以PBS清洗，進行胰酶消化，制成單細胞懸液。以細胞濃度為1×1010/L接種于培養瓶中，常規培養1 d，換液，分別加入3中濃度的二甲雙胍(0、1、5、10 mmol/L)溶液，培養24、48、72 h時，取出培養瓶，胰酶消化成單細胞懸液，離心分離去上清，收集細胞于離心管中，PBS洗滌，加1 mL預冷的70%乙醇，4 ℃固定，24 h后離心分離去上清，加1 mL預冷PBS，使細胞懸浮混勻；并加0.5 mL碘化丙啶予以染色，37 ℃避光孵育30 min，通過流式細胞儀于488 nm波長處測定MKN-45干細胞凋亡情況。

1.2.6 RT-qPCR檢測MKN-45干細胞wnt/β-catenin信號通路相關基因表達情況 收集1.2.4中不同濃度二甲雙胍處理的(24、48、72 h)MKN-45干細胞，通過RNA提取試劑盒提取細胞總RNA。按照PrimeScript RT試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，逆轉錄體系10 μL。β-catenin、GSK-3β以β-actin作為內參，引物序列見表1。參照SYBR? Premix Ex TaqTM II試劑盒說明書進行PCR擴增預變性、變性、退火、延伸反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55～60 ℃ 40 s，72 ℃ 1min，40個循環，72 ℃再延伸10 min。予以2-ΔΔCt法進行數據分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 胃癌干細胞的培養及鑒定

胃癌細胞系MKN-45在無血清培養基7 d后形成各自的懸浮球體細胞(圖1A)；隨著培養時間的繼續延長，培養到15 d時腫瘤球體細胞排列致密，中心密度高，呈現腫瘤細胞富集(圖1B)。免疫熒光檢測結果顯示，與胃癌干細胞分選前相比，分選后MKN-45腫瘤細胞球中CD44+(綠色熒光顯示含有CD44+的細胞)數量增加(圖1C、圖1D)。進一步流式細胞術對CD44+定量顯示，與胃癌干細胞分選前相比，分選后CD44明顯富集，CD44+比例在MKN-45細胞中由5.70%富集至89.32%(圖1E、圖1F)，提示CD44+細胞分選成功；免疫印跡結果顯示，懸浮MKN-45腫瘤細胞球中腫瘤干細胞標志物SOX2、OCT4、Nanog蛋白高于貼壁細胞 (P<0.05)(圖1G、圖1H)，提示懸浮球體細胞具有腫瘤干細胞特性。

表1 引物序列

2.2 不同濃度二甲雙胍對MKN-45干細胞增殖活力的影響

與未處理的MKN-45干細胞相比，經不同濃度(1、5、10 mmol/L)二甲雙胍處理的MKN-45干細胞在48 h及72 h增殖能力下降 (P<0.05)，且呈時間與劑量依賴性。見圖2。

2.3 不同濃度二甲雙胍對MKN-45干細胞凋亡情況的影響

與未處理的MKN-45干細胞相比，經不同濃度(1、5、10 mmol/L)二甲雙胍處理的MKN-45干細胞隨時間延長(48～72 h)及濃度增加，細胞凋亡率也隨之增加(P<0.05)，且呈時間與劑量依賴性。見圖3。

2.4 不同濃度二甲雙胍對MKN-45干細胞β-catenin、GSK-3β基因表達影響

與未處理的MKN-45干細胞相比，隨著二甲雙胍處理濃度增加及處理時間的延長，MKN-45干細胞β-catenin mRNA表達呈下調趨勢，GSK-3β mRNA表達呈上調趨勢(P<0.05)，且呈時間與劑量依賴性。見圖4。

3 討論

腫瘤干細胞在腫瘤組織中數量極少，具有較強的自我更新、多向分化及無限增值的能力殖。近些年來，越來越多的研究報道了在胃癌、結腸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤中存在腫瘤干細胞[14]。已有研究[15-16]證實，胃癌干細胞在化療藥物的耐藥方面顯著強于普通胃癌細胞。因此，靶向胃癌干細胞已成為現階段臨床治療胃癌新的方向。

本研究中胃癌細胞株MKN-45在超低粘附板中培養，在無血清培養基7 d后形成各自的球體細胞，培養15 d時腫瘤球體細胞排列致密，中心密度高，呈現腫瘤細胞富集。研究[17-18]顯示，CD44+、SOX2、OCT4、Nanog是腫瘤干細胞中常見生物標記物，本研究通過檢測腫瘤干細胞標記物來鑒定胃癌干細胞的培養及分選情況，免疫熒光顯示，與分選前相比，胃癌干細胞分選后，CD44+表達增加，且流式細胞術也顯示，分選后CD44+明顯富集，CD44+比例在MKN-45細胞中由5.70%富集至89.32%，同時懸浮MKN-45腫瘤細胞球中腫瘤干細胞標志物SOX2、OCT4、Nanog蛋白高于貼壁細胞。進一步證實本研究胃癌干細胞分選成功，可成為靶細胞應用于二甲雙胍抗胃癌作用機制的研究[19]。

二甲雙胍是一種用于治療2型糖尿病的臨床藥物，有研究[20]認為，該藥對預防癌癥的發生及降低癌癥死亡風險具有促進作用，已有多項研究表明，二甲雙胍可通過調控相關基因起到抑制腫瘤增殖及誘導腫瘤細胞凋亡的作用。Teufelsbauer等[20]報道發現，二甲雙胍可通過間接介導人脂肪基質細胞的支持活性在乳腺癌中發揮抗癌活性。Gulati等[9]研究認為，塞來昔布聯用二甲雙胍可通過抑制局部粘著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)、n-鈣粘蛋白和基質金屬蛋白酶-9活性來抑制非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲。本研究CCK-8結果顯示，與未處理的MKN-45干細胞相比，經過不同濃度(1、5、10 mmol/L)二甲雙胍處理的MKN-45干細胞在48 h及72 h增殖能力下降，且呈時間與劑量依賴性，表明二甲雙胍具有抗胃癌干細胞的增殖的活性，且與其劑量及作用時間成正比。同時本研究又對胃癌干細胞的凋亡機制進行了研究，結果顯示，與未處理的MKN-45干細胞相比，經過二甲雙胍處理時間的延長(48～72 h)及濃度增加，MKN-45干細胞凋亡率也隨之顯著增加，且呈時間與劑量依賴性，說明二甲雙胍濃度越高，作用時間越長，其誘導胃癌干細胞的凋亡就越顯著。分析原因可能與二甲雙胍腫瘤抑制機制有關：(1)通過活化調控胰島素/胰島素樣生長因1軸、腺苷活化蛋白激酶、阻滯腫瘤細胞周期以及調節能量代謝平衡等，進而起到直接抑制腫瘤細胞增殖的作用[21]；(2)通過調節腸道菌群、激活免疫機制，并與各類抗腫瘤藥物協同發揮間接抑制腫瘤的作用[21]；(3)二甲雙胍可能激活Wnt/β-catenin信號通路，調節細胞黏附分子如β-catenin，來調節腫瘤細胞的增殖遷移，并激活下游相關增殖凋亡基因(cyclilnD1、c-myc)表達，來調控腫瘤細胞的增殖凋亡[22]。

多項研究[23-24]已表明，Wnt/β-catenin信號通路參與胃癌細胞及其干細胞的增殖、凋亡等生物學作用機制，通過采用合適的治療手段來抑制胃癌干細胞內Wnt/β-catenin信號通路的活性，已成為現階段靶向治療胃癌的重要研究方向。Fan等[25]研究報道，通過上調胃癌干細胞中miR-501-5p表達，可使Wnt/β-catenin信號通路被過度激活，進而介導胃癌干細胞樣表型。Akrami等[26]研究報道，布洛芬可通過改變Wnt/β-catenin信號通路及其下游相關基因的表達等來抑制Wnt信號通路，起到抗胃癌干細胞增殖的作用。

Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin因子分布于細胞膜，起到維持同型細胞間黏連的作用，其表達的上調可激活Wnt/β-catenin 信號通路，而GSK-3β作為Wnt/β-catenin信號通路的負調節因子，可與軸蛋白、結腸腺瘤息肉易感基因等形成復合體，促進β-catenin的磷酸化，致使β-catenin被水解[27]。然而現階段關于二甲雙胍通過介導Wnt/β-catenin信號通路來影響胃癌干細胞增殖凋亡機制的研究鮮有報道。本研究RT-qPCR檢測結果顯示，與未處理的MKN-45干細胞相比，隨著二甲雙胍處理濃度增加及處理時間的延長，MKN-45干細胞β-catenin mRNA表達呈顯著下調趨勢，GSK-3βmRNA表達呈顯著上調趨勢，提示二甲雙胍對胃癌干細胞的增殖抑制及凋亡促進與抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活有關。

綜上所述，隨著二甲雙胍濃度的增加及作用時間的延長，可促進胃癌干細胞增殖活性的增強及凋亡率降低，其作用原因可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活有關。本研究存不足之處在于，由于實驗條件有限，未直接驗證Wnt/β-catenin信號通對胃癌干細胞增殖凋亡機制的影響，僅對二甲雙胍影響胃癌干細胞增殖凋亡機制與Wnt/β-catenin信號通路關系可能性進行初步探討，后續可就此問題進一步深入研究。