紅白錦鯉ARTP誘變試驗總結

李 泓，王延暉，謝國強，于 瀟，王冰柯，朱文錦

（河南省水產科學研究院，鄭州450044）

常溫常壓等離子體 （Atmospheric and Room Temperature Plasma）簡稱ARTP，指能夠在大氣壓下產生溫度在25～40℃之間、具有高活性粒子濃度的等離子體射流，通過照射使生物細胞壁、細胞膜的結構及通透性發生改變，進一步引起核酸損傷，最終產生可穩定遺傳的變異體。ARTP照射技術作為一種物理誘變方法，可廣泛用于微生物、動物、植物育種，是近年來發展極為迅速的新技術。目前，ARTP誘變技術已成功應用于包括細菌、放線菌、真菌、酵母、微藻等在內的六十余種微生物的誘變育種，在微生物進化研究和微生物工業生產方面發揮著巨大作用；但由于不同生物體生長和結構的差異，該技術在植物、動物體上的應用難度較大，研究相對較少。

紅白錦鯉（Cyprinus carpiohaematopterus）是錦鯉中的基礎品種，社會知名度和認可度較高。鯉科觀賞魚養殖技術較成熟，其生長優勢較明顯。紅白錦鯉的顏色較簡單，誘變對顏色的影響較易識別。本試驗通過對紅白錦鯉受精卵進行ARTP誘變處理，找出不同照射方案下魚卵孵化和生長情況的差異，進而比較最優化照射誘變方案，探索通過ARTP技術進行錦鯉誘變育種的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

受精卵來自泌陽縣帝苑錦鯉養殖場。母本為優質紅白錦鯉，父本為優質銀鱗紅白錦鯉，親魚均達到3齡以上，雄魚體長50 cm，雌魚體長55 cm，體重3～3.5 kg。2020年10月14日進行人工授精，隨即將受精卵平鋪在網片上，網片及受精卵充氧裝袋后運輸至河南省水產科學研究院漁業科研試驗中心，進行ARTP照射試驗。

1.2 試驗方法

受精后6 h左右，在顯微鏡下觀察受精卵發育程度，當大部分受精卵處于原腸胚期時，開始照射試驗。照射時間和照射強度分別設置三個水平，采用雙因素交叉分組，另設1組為對照組。實驗組編號見表1。

表1 ARTP照射分組

1.3 出苗培育

照射后的受精卵按順號移入相同規格80 cm×40 cm×60 cm水族箱內，單獨孵化飼養，水溫控制在17～20℃，箱內放置加溫棒和充氣棒24 h加溫、充氧。3 d后出膜，前3 d投喂蛋黃漿，而后轉為豐年蟲。各組保持一致的飼養管理條件，氣溫轉暖后，移入室外5 m×5 m硬化水泥池。統計各組孵化率和成活率。

2結果與分析

2.1 總體成活率分析

實驗組與對照組受精卵成活率存在較大的差異，對照組37.43%，試驗組10%左右。在試驗組與試驗組之間，成活率差異不顯著（圖1、表2）。排除由于秋季育苗導致整體成活率不高的因素，通過ARTP照射的受精卵較沒有照射的受精卵折損率為75%，即減產3/4。實驗組受精卵成活率的高低，決定了實驗樣本基數的大小，可以作為優化ARTP照射方案的一項參考依據。

表2 孵化情況統計

表3 生長情況統計（3個月）

圖1 總成活率圖

2.2 照射強度和照射時間對成活率的影響

通過比較不同照射強度和照射時間下的成活率（圖2），發現不同強度照射下受精卵成活率不穩定，差異較大；不同時間的照射下受精卵成活率相差不大，且趨于穩定。因此影響受精卵成活率的因素，照射強度＞照射時間。在優化ARTP照射方案上，可以縮短照射時間，以主要控制照射強度為手段進行誘變照射。

圖2 照射時間和照射強度對成活率的影響

2.3 突變率的體現

ARTP照射試驗的主要目的就是得到能穩定生長的突變種，在受精卵孵化后的生長階段，部分個體因誘變導致發育畸形，進而在孵化后的一段時期內發生生長中斷，因此通過統計前三個月的死亡率，可以一定程度上反映照射產生的突變率。通過統計分析發現，照射強度越高的實驗組，在生長的第一個月內幼苗死亡率越高，且最高的實驗組死亡率接近70%（圖3）；第二個月至第三個月生長趨于穩定，死亡現象較少發生。高畸形率導致了高死亡率的產生，另一方面高畸形率也是增加突變率的體現，因此在本次實驗中，較高強度的照射方案誘變效果更好，可以作為優化ARTP照射方案的一項重要依據。

圖3 第一個月死亡率對比圖

2.4 照射對生長速度的影響

通過分析前三個月實驗組與對照組幼苗生長體長情況發現（圖4）：實驗組生長速度均超過對照組，且在第2個月較為明顯；實驗組之間的生長速度差異不顯著。生長速度不同可以作為ARTP照射的一項評價指標，但由于魚苗較小，實驗組各組樣本基數不一且相對較小，前期的生長情況要與后期成魚的生長情況綜合評價。

圖4 前三個月魚苗體長情況

3 討論

綜合分析樣本基數、突變率和生長情況，第7組表現較優，后期將基于該組照射時間和強度，繼續優化ARTP誘變育種的照射方案。通過此次受精卵ARTP誘變照射試驗的實施，課題組認為通過ARTP進行觀賞魚誘變育種是可行的。但是有別于微生物的ARTP誘變育種，動物或植物的常溫常壓等離子誘變更多的是關注試驗過程對個體的影響，其不確定因素更多，需要進一步探索誘變研究的規律和操作規范。

同時，通過本次試驗，也發現了一些問題。一是秋季育苗的問題。雖然理論上秋季育苗錦鯉是可行的，但是在實際操作中難度很高，需要完備的硬件設施、優良的實驗材料和成熟的人工授精技術。二是幼苗的體質問題。此次試驗幼苗的體質相對較弱，雖然進行了對照組實驗對比，但對數據的準確性有一定的影響。三是實驗樣本過少。對試驗結果的預估不足，導致最終成活的實驗樣本過少，不能形成穩定的數據構架，導致如2#、4#存在較大誤差的實驗組情況。四是試驗起步較晚。對實驗組和對照組成魚的觀察是此次試驗的重要內容，但目前受季節影響，魚苗生長速度較慢，試驗周期過長。下一步工作重點，總結評估試驗效果，進一步優化實施方案，在春、夏季開展試驗，以彌補此次試驗的遺憾和不足。