響應面法優化南極磷蝦油微膠囊噴霧干燥制備工藝的研究

苗鈞魁，魏書磊，劉小芳，于 源，張笑梅，冷凱良,

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業農村部極地漁業開發重點實驗室，山東青島 266071；2.青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東青島 266200；3.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266100）

南極磷蝦油是從南極磷蝦中提取的具有保健療效的油脂。研究認為，南極磷蝦油富含ω-3、ω-6 類多不飽和脂肪酸以及蝦青素等活性物質[1]，除了具備預防炎性反應疾病、心腦血管疾病、老年癡呆癥、糖尿病等重大疾病的功效[2?6]，在體內還可以起到清除自由基、修復DNA 損傷、抗炎活性、改善認知能力等作用[5,7?10]。另外，蝦青素作為一種抗氧化能力極強的內源性抗氧化劑，對防止油脂氧化變質也起到一定作用[11]。

目前，在開發利用南極磷蝦油方面還存在諸多問題，表現為產品以軟膠囊為主，劑型單一；易變質，儲存條件要求高；磷脂含量高，易乳化，應用范圍受限制[1,12]。運用微膠囊技術，將南極磷蝦油包在毫米至微米大小的膠囊中，可以隔絕與外界的接觸，延長產品的貯藏時間，提高產品的溶解度，保護活性成分不被破壞[13]。針對油性內容物的微膠囊化方法主要有：噴霧干燥法[14]、復凝聚法[15]、真空冷凍干燥法等。本研究采用的噴霧干燥法是將芯材分散在壁材溶液中，在高溫氣流中將芯材、壁材的混合溶液霧化，使溶液中的溶劑迅速蒸發，最終使壁材固化而得到微膠囊產品[16]。較其他方法，噴霧干燥法具有操作簡便，成本較低的優點，微膠囊化產品顆粒大小均勻，產品質量好，易于實現規模化生產，是微膠囊技術中應用最為廣泛的方法[17]。暴莎莎[18]利用麥芽糊精和明膠為壁材，噴霧干燥法制備了表面較光滑、無褶皺的南極磷蝦油微膠囊，包埋率達到74.15%。趙鑫鵬等[19]以海藻酸鈉與殼聚糖為壁材，采用銳孔法制備南極磷蝦油微膠囊，包埋率達到86.45%。戴妍等[20]比較了不同壁材生產蛋黃卵磷脂微膠囊的包埋率和性能等指標，說明壁材的選擇對微膠囊性能優劣具有關鍵作用。包埋率是影響微膠囊品質的主要指標。包埋率低，附著在微膠囊表面的油脂多，微膠囊極易氧化變質，儲存難度大，生產成本高，無法進入商業化生產。本文使用酪蛋白酸鈉、明膠、麥芽糊精作為壁材，制備南極磷蝦油微膠囊，在單因素基礎上，以包埋率為響應值，采用響應面法優化了南極磷蝦油微膠囊的配方工藝，并探索了微膠囊的理化性質，為南極磷蝦油工業化生產提供了工藝支持和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦油 食品級，南極維康有限公司；明膠 食品級，山東恒源康生物科技有限公司；酪蛋白酸鈉 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；麥芽糊精、正己烷、乙石油醚 分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司。

BILON-6000Y 實驗室小型噴霧干燥機 上海比朗儀器制造有限公司；JZH50-80 高壓均質機 上海錦竹機械設備有限公司；RE-52AA 旋轉蒸發器 鄭州科泰實驗設備有限公司；BAS224S-CW 電子分析天平 德國賽多利斯科學儀器有限公司；Zs90 激光粒度分析儀 英國Malvern Zatasizer Nano 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南極磷蝦油微膠囊的制備 稱取一定質量的酪蛋白酸鈉、明膠、麥芽糊精分別溶解，酪蛋白酸鈉直接溶解到70℃蒸餾水中，濃度約為6%，明膠經少量水溶脹后加入到酪蛋白酸鈉溶液中，麥芽糊精直接加入到酪蛋白酸鈉溶液中，用磁力攪拌器攪拌直至充分混合，冷卻至50 ℃，得到壁材溶液；取一定質量的南極磷蝦油，水浴加熱至50 ℃左右，邊攪拌邊加入到壁材溶液中，磁力攪拌器充分攪拌，經高壓均質機均質后得到乳化液，均質壓力設定為35 MPa，均質3 次。將此乳化液通過噴霧干燥機噴霧干燥得到南極磷蝦油微膠囊，進風溫度設定為200 ℃，進料量為20 mL/min。

工藝流程：

配料（水、壁材、南極磷蝦油）→乳化→高壓均質→噴霧干燥→微膠囊

1.2.2 檢測方法 包埋率計算公式：

測定產品表面油：首先，準確稱取適量的微膠囊產品，記作M，用一定體積的正己烷浸提大約2 min后，過濾，再用2 倍體積正己烷進一步浸提，過濾，收集兩次濾液，放入旋蒸瓶進行旋蒸，直到正己烷完全出去為止，其質量記做m。

表面油計算公式：

測定產品總油：參考GB 5009.6-2016 中脂肪的測定方法，略有改動。將分液漏斗放置于架子上，向分液漏斗內加入1～2 g 南極磷蝦油微囊和10 mL 60 ℃熱水，振搖破壁，肉眼觀察不能有大顆粒，先后加入10 mL 無水乙醇、50 mL 石油醚，充分振搖，靜置30 min 直到清晰分層，用吸管吸取上層液體，轉移至旋蒸瓶內，濃縮得到總油。

1.2.3 單因素實驗 選取各因素條件梯度：酪蛋白酸鈉用量16%、20%、24%、28%、32%，明膠用量4%，芯壁質量比1:3；明膠用量2%、4%、6%、8%、10%，酪蛋白酸鈉20%，芯壁質量比1:3；芯壁質量比：1:1.5、1:2、1:3、1:4，酪蛋白酸鈉24%，明膠6%。固形物（芯材和壁材總和）濃度25%，不足濃度以麥芽糊精填充。

1.2.4 響應面試驗設計 綜合單因素實驗結果確定顯著因素和最佳條件，對明膠 A、酪蛋白酸鈉 B、芯壁質量比C 設計了三因素三水平響應面優化試驗。以 A、B、C 為自變量，以南極磷蝦油微膠囊包埋率為響應值，采用 Design-Expert10.0 進行響應面中心組合設計，實驗因素及水平設計見表1 。

表1 因素及水平表Table 1 Factors and levels table

1.2.5 南極磷蝦油微膠囊理化性質的測定

1.2.5.1 水分含量的測定 按照食品安全國家標準GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》中直接干燥法測定。

1.2.5.2 灰分的測定 參照食品安全國家標準GB 5009.4-2016 中的高溫灼燒法測定。稱取5 g 左右微膠囊，加入1.00 mL 乙酸鎂溶液（240 g/L）使試樣完全潤濕。放置10 min 后，在水浴上將水分蒸干，在電熱板上以小火加熱使試樣充分炭化至無煙，然后置于高溫爐中，在550±25 ℃灼燒4 h。冷卻至200 ℃左右，取出，放入干燥器中冷卻30 min，稱量。重復灼燒至前后兩次稱量相差不超過0.5 mg 為恒重。

1.2.5.3 吸濕性的測定 首先，在表面皿中放入10～20 g 的樣品，放置于干燥器中，脫濕12 h 以上；然后，將表面皿置于藥品穩定性試驗箱內，設置濕度75%，溫度25 ℃，每隔1 h 取出表面皿，精密稱量1 次，放回試驗箱，平行測定3 次；最后，根據記錄數據計算吸濕增重并繪制樣品12 h 吸濕曲線。

1.2.5.4 粒徑的測定 取少量微膠囊粉末溶于燒杯中，待全部溶解后，取適量置于玻璃皿中，用Zs90 激光粒度分析儀測定微膠囊平均粒徑大小。

1.2.6 南極磷蝦油微膠囊機械強度 參照文獻[21]報道方法，利用離心法研究南極磷蝦油微膠囊在不同pH 環境中的機械強度。取一定量的微膠囊，于3 支離心管中，加入一定體積的超純水，混勻，使其充分分散，然后用0.1 mol/L 的鹽酸或氫氧化鈉分別調PH 至3.0、4.0、7.0，于1000 r/min 下分別離心15、30、45、60 min。控制在4 ℃，盡可能的減少溶劑的揮發和油酯降解。離心后，向體系中加入一定體積的正己烷，50 r/min 渦旋3 min，靜置10 min，收集正己烷相，旋蒸除去正己烷即得到釋放油脂，以離心前樣品作為對照，分析南極磷蝦油的釋放情況。

計算離心過程中由于離心作用力釋放出的南極磷蝦油占樣品中總南極磷蝦油酯的百分含量定義為釋放率，按照下式（3）進行計算：

式中：m0表示體系中南極磷蝦油的總量，mg；mt表示離心時間為t 時，體系中釋放出的南極磷蝦油總量，mg；m0表示未被包埋的南極磷蝦油，即離心前（0 min）樣品中釋放出的南極磷蝦油，mg。

1.3 數據處理

重復所有實驗至少3 次，結果表示為平均值±標準差（SD）。采用Excel2010 和Origin2018 軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 酪蛋白酸鈉對南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響 圖1 顯示了明膠用量4%時，同等梯度酪蛋白酸鈉用量，酪蛋白酸鈉以及酪蛋白酸鈉和明膠共同作為壁材時（均添加適量麥芽糊精），南極磷蝦油微膠囊包埋率的差異。從圖1 可以看出添加明膠后南極磷蝦油微膠囊包埋率明顯提高。因此，選用酪蛋白酸鈉和明膠作為南極磷蝦油微膠囊的壁材。從圖1 中酪蛋白酸鈉和明膠共同作為壁材時微膠囊包埋率的曲線可以看出，包埋率隨著酪蛋白酸鈉用量的增加先上升后下降，在酪蛋白酸鈉用量為24%時達到最高值90.2%±0.34%。因此，酪蛋白酸鈉的用量24%為宜。

圖1 添加明膠和不添加明膠兩種情況下南極磷蝦油微膠囊包埋率的差異Fig.1 Differences in the embedding rate of Antarctic krill oil under single and composite wall materials

2.1.2 明膠用量對南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響 明膠用量對南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響，如圖2 所示，明膠用量由2%增加到4%時，微膠囊的包埋率迅速上升，在4%時達到最大值92.6%±0.34%，而后出現下降趨勢。因此，明膠的用量以4%為宜。

圖2 明膠對南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響Fig.2 Effect of gelatin on embedding rate

2.1.3 芯壁質量比對南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響 由圖3 可知，隨著芯材與壁材質量比的降低，南極磷蝦油包埋率增加，當芯材與壁材的比例提高到1:3 時，達到91.6%±0.45%。芯材載量過高時，生產成本低，但是微膠囊囊壁厚度過低，滲透性高，南極磷蝦油的包埋率低，穩定性差；降低芯壁質量比，可以增加微膠囊壁厚度，降低微膠囊的滲透性，防止芯材流失或受氧氣、水蒸氣等外在因素的影響，延長微膠囊的貨架期，但是生產成本增加。所以，綜合考慮微膠囊性能和生產成本，選擇芯壁質量比為1:3 作為制備南極磷蝦油微膠囊的最佳工藝條件。

圖3 芯壁質量比對南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響Fig.3 Effect of the core-wall mass ratio on embedding rate

2.2 響應面法優化分析

響應面分析方案及實驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken 中心組合實驗設計及實驗結果Table 2 Design and experimental results of Box-Behnken central composite

由表3 可知，模型的決定系數R2=0.9988，表示模型的相關度非常好，模型調整系數R2=0.9973，表明模型能解釋99.73%的響應值變化，模型失擬項P=0.1515>0.05，表明模型顯著性較好，因此可以根據該數學模型，預測和分析南極磷蝦油微膠囊制備工藝中不同的配料比下微膠囊的包埋率，輔助設計新的配方工藝。擬合回歸方程：包埋率（%）=92.63+1.43625A+0.9375B?1.95625C?0.3425AB?0.585AC+0.2525BC?5.6825A2?5.12B2?2.8225C2。其中，A、B、C、A2、B2和C2項均是影響極顯著的因素（P<0.01），AB 項為影響顯著的因素（P<0.05），對南極磷蝦油微膠囊包埋率影響大小順序依次為：芯壁比>明膠>酪蛋白酸鈉。BC 交互作用不顯著，AB、AC 的交互作用顯著，表明各個影響因素與響應值之間不是簡單的線性關系，圖4、圖5、圖6 更直觀描述了3 因子對響應值的影響。

表3 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗Table 3 Analysis of variance and significance test of regression model

圖4 明膠和酪蛋白酸鈉交互影響的響應面圖Fig.4 Response surface diagram of interaction between gelatin and sodium caseinate

圖5 酪蛋白酸鈉和芯壁質量比交互影響的響應面圖Fig.5 Response surface diagram of interaction between sodium caseinate and the core-wall mass ratio

圖6 明膠和芯壁質量比交互影響的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of interaction between gelatin and the core-wall mass ratio

2.3 驗證試驗

為驗證模型的可靠性，選用優化的參數，酪蛋白酸鈉用量24.55%、明膠用量4.86%、芯壁比0.33、麥芽糊精用量45.60%，進行3 次平行實驗，得到南極磷蝦油微膠囊包埋率為93.79%±0.12%，與理論預測值92.65%比較，誤差在3%以內，說明模型準確可靠。

2.4 南極磷蝦油微膠囊的理化性質

南極磷蝦油微膠囊產品呈粉末狀，水分含量越低，越有利于防止產品結塊或霉變。如果產品吸濕性高，在儲存過程中容易引起粉末吸潮導致結塊，流動性降低，顏色變深，易滋生微生物，影響產品的應用和儲存性能。在該實驗條下制得的南極磷蝦油微膠囊產品水分含量2.31%±0.11%，置于75%的高濕度環境下12 h，在初始的2～3 h，微膠囊增重明顯，隨著時間的推移，增加的重量逐漸減小，在7.5 h 后增加幅度變緩（圖7）。這說明微膠囊具有較強的吸濕能力，需要在干燥密封的條件下貯藏。微膠囊粒徑在7～48 μm 之間，集中在14.8～26.7 μm，且呈正態分布（圖8）。灰分含量為2.04%±0.14%。

圖7 南極磷蝦油微膠囊吸濕性曲線Fig.7 Hygroscopicity curve of Antarctic krill oil microcapsules

圖8 南極磷蝦油微膠囊粒徑測定結果Fig.8 Results of particle size measurement of Antarctic krill oil microcapsules

2.5 pH 對南極磷蝦油微膠囊機械強度的影響

通過考察南極磷蝦油微膠囊在不同pH 環境下的釋放，評價pH 對南極磷蝦油微膠囊機械強度的影響，以便為南極磷蝦油微膠囊產品的制備和應用提供參考。圖9 描述了不同pH 條件下南極磷蝦油微膠囊芯材在離心過程中的釋放情況。由圖9 可以看出，在不同的pH 環境和離心時間條件下，微膠囊中南極磷蝦油釋放率小于0.3%，釋放量幾乎可以忽略，表明南極磷蝦油微膠囊的機械強度和抗離心能力非常強，結構非常穩定。微膠囊的強度取決于膠囊的直徑和囊殼的厚度，也與壁材關系密切[22]。推測微膠囊機械強度高的原因是明膠使酪蛋白酸鈉溶膠體系重組而改變原有的聚合物空間結構，兩性親水物質酪蛋白酸鈉和明膠之間的生物相容性、協同增效作用增強，使微膠囊囊壁的機械強度顯著性提高[23]。酪蛋白酸鈉和明膠兩種分子間的氫鍵作用，使囊壁的膜結構更加緊湊，阻水性明顯提高；明膠側基-NH3+與酪蛋白酸鈉解離的負離子間靜電力相互作用，使囊壁的拉伸強度提高[23]。

圖9 不同pH 環境下南極磷蝦油微膠囊芯材釋放率隨離心力時間的變化Fig.9 Variation of Antarctic krill oil microcapsules release rate versus centrifugation time in different pH conditions

3 結論

本實驗利用噴霧干燥法制備南極磷蝦油微膠囊，在單因素實驗的基礎上，利用響應面試驗確定了南極磷蝦油噴霧干燥法微膠囊化的最佳配方工藝為：酪蛋白酸鈉用量24.55%、明膠用量4.86%、芯壁比0.33，麥芽糊精質量分數為45.60%，此條件下得到的南極磷蝦油包埋率為93.79%。微膠囊水分含量2.31%±0.12%，吸濕性強，需儲存于干燥密閉的環境里，灰分含量為2.04%±0.14%，粒徑在14.8～26.7 μm之間。微膠囊機械強度高，結構穩定，初步認為可應用于食品加工。根據響應面試驗結果，得出酪蛋白酸鈉用量、明膠用量、芯壁質量比對南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響極顯著，且三者對南極磷蝦油微膠囊包埋率影響大小順序依次為：芯壁比>明膠>酪蛋白酸鈉，各實驗因素對南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響程度并非簡單的線性關系。本文所建立預測模型可以用于南極磷蝦油微膠囊包埋率的預測。