復合護色劑抑制杏酒褐變的工藝優化

徐 佳，涂智鴻，楊建飛，黃雪芹，馬 倩，易 媛，左 勇,,3,

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓 644000；2.四川師范大學生命科學學院，四川成都 610000；3.成都裕智果業有限公司，四川成都 610000）

杏是多年生木本植物的果實，廣泛種植于我國的黃河流域各省[1]。杏肉棉軟多汁，口感酸甜，風味獨特，富含氨基酸、維生素、類胡蘿卜素[2]、多酚及類黃酮[3]等營養物質。以杏果為原料釀造的杏酒，不僅具有豐富的香氣，還可以將其大部分營養物質保留下來，得到了許多消費者的認可。但杏果極易氧化褐變，特別是在杏酒陳釀和灌裝階段，均會發生明顯的褐變現象，導致杏酒的外觀品質與營養價值嚴重下降。

研究表明，杏果中多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）引起的酶促褐變是導致杏酒褐變的主要原因[4]。所以，控制杏酒的酶促褐變成為抑制其褐變的關鍵，目前國內外有關鮮杏及其加工產品抑制褐變的方法集中在熱處理[5]、可食性涂層[6]、高壓二氧化碳技術[7]、食品護色劑[8]、工藝條件[9]和品種成熟度[10]等方面。其中物理方法被廣泛應用于果蔬的褐變抑制，食品護色劑常用于果酒中的褐變抑制，但僅添加單一護色劑易造成使用濃度高、穩定性差以及效果不明顯等缺點[11?12]。

本研究擬從6 種安全且常用的食品護色劑中，以褐變抑制率和色差值為指標，將前三種護色劑進行復配，得到最佳護色劑配方，可改善杏酒的褐變問題，為杏酒產品的褐變抑制提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮杏果“凱特杏” 四川某杏果基地2019 年6 月采摘，該原料成熟度適中，果實飽滿且無病害；D254 諾盟酵母 法國LAFFORT 公司；異抗壞血酸鈉、L-半胱氨酸、植酸、EDTA-Na2、谷胱甘肽、氯化鈣 國產食品級添加劑。

JYZ-E3 九陽原汁機 九陽股份有限公司；T6 紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；UitraScan VIS 臺式色差儀 HunterLab（美國）有限公司；ME104E/02 電子分析天平 托利多儀器有限公司；STARTER 2C pH 計 奧豪斯儀器有限公司；GZ-250-HS11 恒溫恒濕箱 韶關市廣智科技設備有限公司；精密膜過濾器 煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 杏酒加工 杏果→清洗去核→破碎打漿→接種→發酵→過濾→添加護色劑→陳釀→精濾澄清→裝瓶

杏酒的發酵條件：調整杏漿料液比為4.5:1，初始糖度21%，接種1.2 g/L 的酵母，在25 ℃的條件下，發酵7 d。杏酒發酵結束后過濾，添加護色劑，于20 ℃的條件下放置15 d。再采用精濾設備進行過濾，最后將果酒裝入消毒的空瓶中，加塞。在杏酒發酵結束到陳釀之間的過濾和轉移過程，最易發生氧化褐變現象，所以選擇此時研究添加護色劑的效果。

1.2.2 單因素實驗 杏酒發酵結束過濾后，保留部分酒樣做空白對照，再根據文獻查閱和預試驗處理結果向其他酒樣中添加不同濃度的單一護色劑[13]：異抗壞血酸鈉（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L），L-半胱氨酸（0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 g/L），植酸（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%），EDTA-Na2（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L），谷胱甘肽（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L），氯化鈣（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）。在20 ℃的條件下放置15 d，分別測定杏酒褐變抑制率和色差值，探究護色劑對杏酒褐變的抑制效果。

1.2.3 正交試驗 在單因素實驗基礎上，對六種護色劑進行六因素二水平正交試驗，以杏酒褐變抑制率和色差值為指標，對試驗結果進行分析，得到影響杏酒褐變抑制率和色差值的主次順序，正交試驗因素水平見表1。

1.2.4 響應面試驗設計 在正交試驗的基礎上，選擇對杏酒褐變影響最大的三種護色劑：異抗壞血酸鈉（A）、植酸（B）、L-半胱氨酸（C），根據Box-Behnken 響應面設計原理，進行三因素三水平的中心組合試驗，以褐變抑制率和色差值為指標，確定杏酒復合護色劑的最佳配比，因素水平見表2。

1.2.5 褐變度及褐變抑制率的測定 杏酒褐變度的測定參照Lopez-Toledano 等[14]的方法并稍作改進，取待測酒樣上清液10 mL 作為待測樣品。利用紫外分光光度計，以蒸餾水為空白，在420 nm 處測定杏酒上清液的吸光度A，即杏酒褐變度。杏酒褐變抑制率（R）按照下式進行計算：

表1 正交試驗設計因素水平表Table 1 Variables and their levels used in orthogonal experimental design

表2 響應面試驗因素水平設計Table 2 Factors and their levels designed in response surface design

式中：R 為褐變抑制率；A0為空白對照的杏酒褐變度；Am為護色劑處理后的杏酒褐變度。

1.2.6 色度的測定 采用色差儀測定杏酒的色度，以透射模式10°觀察模式測定樣品L*、a*、b*值；其中L*表示亮度值，a*表示綠紅值，b*表示藍黃值；用dE*（色差值）描述樣品的顏色變化，以發酵結束的杏酒為參比標準溶液，計算色差值dE*，dE*越小表示待測樣品與參比樣品色澤越接近，反之則相差越大，計算公式如下[15]：

1.2.7 理化指標的測定 酒精度：采用分光光度計法測定[16]，將5%的重鉻酸鉀與不同濃度的乙醇反應后，利用分光光度計測量吸光度（600 nm），繪制出酒精度的標準曲線，并以此計算樣品的酒精度。

總酸、還原糖：根據GB/T 15038-2006[17]的方法進行測定。

1.3 數據處理

利用SPSS 20.0 進行單因素方差分析，并用OriginPro 2016 作圖；利用正交設計助手II V3.1 分析正交試驗結果；利用Design-Expert 8.0.6 進行響應面試驗設計與數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 異抗壞血酸鈉濃度對杏酒褐變的影響 異抗壞血酸鈉作為安全的食品添加劑，具有較強的還原性，可將體系中的醌類及其衍生物還原成無色的酚類物質，防止醌類物質聚合形成黑色素，從而達到抑制褐變的效果[18]。由圖1 所示，隨著異抗壞血酸鈉濃度的升高，色差值呈下降趨勢，而褐變抑制率呈先上升后緩慢下降的趨勢。在異抗壞血酸鈉濃度為0.6 g/L 時，褐變抑制率達到最高，為47.83%，顯著高于其他濃度水平（P<0.05），與此同時，色差值下降趨勢也開始逐漸放緩。原因可能在于，當異抗壞血酸鈉濃度超過最佳范圍后，它將醌還原為酚的同時，多余的抗壞血酸也被氧化，并與氨基酸反應導致非酶褐變的發生[19]。綜合考慮色差值和褐變抑制率，異抗壞血酸鈉最佳濃度范圍為0.6～0.8 g/L。

圖1 異抗壞血酸鈉的褐變抑制效果Fig.1 Effects of sodium isoascorbate on browning inhibition

2.1.2 L-半胱氨酸濃度對杏酒褐變的影響 半胱氨酸作為天然氨基酸，它能夠抑制褐變的主要機理在于其含有具還原性的巰基，能夠作為醌類物質的螯合劑，與醌作用生成穩定的無色化合物[20]。此外，它還可以直接作用于多酚氧化酶（PPO），降低其活性[21]。由圖2 所示，隨著L-半胱氨酸濃度的增大，杏酒的褐變抑制率先升高后穩定，而色差值則呈先下降后上升的趨勢，可能是因為當濃度超過最佳范圍后，杏酒自身發生了非酶促褐變，導致顏色加深[22]。在L-半胱氨酸的濃度為1.2 g/L 時，色差值最小，為23.02，此時褐變抑制率也趨于穩定，達到了45.58%。L-半胱氨酸雖具有一定的營養價值，但其具有氨基酸特有的味道，添加量過多會在一定程度上影響杏酒的香氣。綜合考慮色差值和褐變抑制率，L-半胱氨酸最佳濃度范圍為0.9～1.2 g/L。

圖2 L-半胱氨酸的褐變抑制效果Fig.2 Effects of L-cysteine on browning inhibition

2.1.3 植酸濃度對杏酒褐變的影響 植酸是從天然植物中提取的多功能食品添加劑，常作為果蔬護色劑，能與輔酶中的金屬離子發生螯合，抑制PPO 和POD 活性，減緩酶促褐變和非酶褐變的發生[23?24]；作為發酵促進劑，可增加菌體生長的酶系促進產物的生成[25]；作為果酒的澄清劑，可阻止金屬離子參與蛋白質、單寧等物質的締合和絮凝[26]。由圖3 所示，隨著植酸濃度的增加，褐變抑制率呈先上升后下降的趨勢，色差值呈先下降后上升的趨勢，說明濃度過高的植酸會對褐變抑制造成負影響。當植酸濃度為0.02%時，褐變抑制率達到最高，為40.51%，色差值則降至最低，為25.07。綜合考慮色差值和褐變抑制率，植酸最佳濃度范圍為0.02%～0.03%。

圖3 植酸的褐變抑制效果Fig.3 Effects of phytic acid on browning inhibition

2.1.4 EDTA-Na2濃度對杏酒褐變的影響 EDTANa2是一種含有羧基和氨基的螯合劑，通過螯合體系中對褐變反應具有促進作用的金屬離子，來達到抑制褐變的效果[12]。由圖4 所示，隨著EDTA-Na2濃度的增大，其褐變抑制率呈先上升后下降的趨勢，在0.4 g/L時達到最高，為41.57%；色差值呈先下降后上升的趨勢，在0.6 g/L 時降至最低，為24.98。EDTA-Na2的效果雖好，但其在水中的溶解度小，若在人體中不分解而排出，會造成人體缺鈣等現象[27]。綜合考慮色差值和褐變抑制率，EDTA-Na2最佳濃度范圍為0.4～0.6 g/L。

圖4 EDTA-Na2 的褐變抑制效果Fig.4 Effects of EDTA-Na2 on browning inhibition

2.1.5 谷胱甘肽濃度對杏酒褐變的影響 谷胱甘肽是一種抗氧化物質，它抑制果酒褐變的機理在于它能夠與醌類化合物發生聚合物反應[28]。也有研究表明[29?30]，它可以通過提高抗壞血酸-谷胱甘肽循環中谷胱甘肽還原酶的活性，加強體系中活性氧的清除能力，從而降低氧化脅迫。由圖5 所示，隨谷胱甘肽濃度的增加，杏酒的褐變抑制率先上升后下降，色差值先下降后上升，這與徐俊南[31]在研究蘋果酒時的結果相似。當谷胱甘肽濃度為0.6 g/L 時，杏酒褐變抑制率達到最高，為36.94%；色差值降至最低，為26.53。綜合色差值和褐變抑制率并結合經濟因素，谷胱甘肽的最佳濃度范圍為0.4～0.6 g/L。

圖5 谷胱甘肽的褐變抑制效果Fig.5 Effects of glutathione on browning inhibition

2.1.6 氯化鈣濃度對杏酒褐變的影響 目前對氯化鈣抑制褐變機理的解釋有兩種，一是氯化鈣對細胞壁及細胞膜完整性的保護，能增強組織的硬度，從而減少多酚類物質外滲與酶類接觸[16,32]；二是Ca2+可競爭性地螯合酶中的Cu2+，從而抑制褐變[33]。如圖6 所示，添加氯化鈣，杏酒的褐變抑制率普遍較低，在氯化鈣濃度為0.6 g/L 時達到最高，僅有26.24%；色差值先下降后趨于穩定，在0.4 g/L 最低，為28.15，與濃度在0.6 g/L 時的色差值相比并無顯著性差異（P=0.142）。綜合色差值和褐變抑制率，氯化鈣的最佳濃度范圍為0.6～0.8 g/L。

圖6 氯化鈣的褐變抑制效果Fig.6 Effects of CaCl2 on browning inhibition

2.2 正交試驗

在單因素實驗的基礎上，將上述6 種護色劑選出兩個水平，然后以L8（27）正交表進行試驗，正交試驗設計及結果見表3。通過極差分析，得到6 種不同護色劑對杏酒褐變抑制率與色差值影響的主次順序，發現影響杏酒褐變抑制率的主次順序為：A>C>B=E>D>F；影響杏酒色差值的主次順序為：A>B>C>D>E>F。

表3 正交試驗設計與結果Table 3 Orthogonal experiment design and results

2.3 響應面試驗

2.3.1 響應面試驗設計及方差分析 根據正交試驗結果，選擇對杏酒褐變抑制率和色差值影響較大的3 種護色劑：異抗壞血酸鈉、L-半胱氨酸、植酸，進行三因素三水平的響應面試驗，其設計及結果見表4。再對響應面結果進行多元回歸擬合分析，分析結果見表5、表6。

表4 響應面試驗設計與結果Table 4 Response surface test design and results

根據試驗結果，對自變量編碼的因素A（異抗壞血酸鈉）、B（L-半胱氨酸）、C（植酸）進行回歸分析并建立模型，可以得到一個二次多項式回歸方程：Y1（褐變抑制率，%）=49.73+1.62A?1.01B?1.72C+1.06AB?3.90AC+0.56BC?1.99A2?2.80B2?2.14C2

由表5 所示，回歸模型P值<0.0001，說明該模型的回歸方程是極顯著的，在統計學上有意義。失擬項P值為 0.4018>0.05，說明失擬項不顯著，無失擬因素存在。模型R2為 97.54%>85%，說明模型的擬合程度較好，可用該回歸方程代替褐變抑制組合試驗真實點對試驗結果進行分析和預測[34]。

表5 褐變抑制率回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance for regression model of browning inhibition rate

在回歸模型中，A、C，AC，A2、B2、C2對褐變抑制率影響為極顯著（P<0.01）；B 和AB 對褐變抑制率的影響顯著（P<0.05）；BC 的影響不顯著（P>0.05）。由此表明各個試驗因子與響應值之間的關系不是簡單的線性關系。

根據試驗結果，對自變量編碼的因素A（異抗壞血酸鈉）、B（L-半胱氨酸）、C（植酸）進行回歸分析并建立模型，可以得到一個二次多項式回歸方程：Y2（色差值）=21.47?0.41A+1.38B+0.70C?0.79AB+1.43AC?0.20BC+2.17A2+1.56B2+1.74C2

由表6 所示，回歸模型極顯著（P=0.0003<0.01），失擬項不顯著（P=0.9853>0.05），模型R2為 96.23%>85%，說明模型的擬合程度較好，可利用該模型預測杏酒的護色劑配方。該模型中B，AC 和A2、B2、C2對色差值的影響是為極顯著（P<0.01）；C、AB 對色差值的影響顯著（P<0.05）；A、BC 對色差值影響不顯著（P>0.05）。

表6 色差值回歸模型的方差分析Table 6 Analysis of variance for regression model of the chromatism

2.3.2 因素間的交互影響 根據各指標與兩個自變量間的等高線和響應面的形狀，可反映交互效應的強弱，揭示交互項對杏酒褐變抑制率和色差值的影響。由圖7～圖8 可知，異抗壞血酸鈉（A）和半胱氨酸（B）的等高線偏圓形，響應面較為陡峭，說明AB 間的交互作用對杏酒褐變抑制率和色差值的影響達到顯著水平；異抗壞血酸鈉（A）和植酸（C）的等高線呈現橢圓形，響應面更陡峭，說明AC 間的交互作用非常顯著，且AC 的交互效應對于杏酒褐變抑制率和色差值的影響程度較高，所以適當調整A 和C 的含量，有利于提高杏酒的褐變抑制率，降低色差值。

圖7 異抗壞血酸鈉與L-半胱氨酸、植酸交互作用對杏酒褐變抑制率的影響Fig.7 Effects of the interaction of sodium isoascorbate with L-cysteine and phytic acid on the browning inhibition rate of apricot wine

圖8 異抗壞血酸鈉與L-半胱氨酸、植酸交互作用對杏酒色差值的影響Fig.8 Effects of the interaction of sodium isoascorbate with L-cysteine and phytic acid on the chromatism of apricot wine

2.3.3 最佳護色劑的確定及驗證試驗 根據響應面試驗，得到最佳的杏酒護色劑配方為：異抗壞血酸鈉0.70 g/L、L-半胱氨酸1.13 g/L、植酸0.01%，在此條件下預測杏酒褐變抑制率為51.52%，色差值為21.42。考慮到試驗的可操作性和可行性，確定最佳的杏酒護色劑配方為：抗壞血酸鈉0.70 g/L、L-半胱氨酸1.10 g/L、植酸0.01%。在此條件下進行3 次驗證試驗，得出杏酒的褐變抑制率為53.11%，色差值為22.35，相對誤差分別為：3.00%和4.16%，測得的酒精度為11.98%vol，還原糖為4.75 g/L，總酸為8.47 g/L，無護色劑添加的杏酒酒精度為12.15%vol，還原糖為4.63 g/L，總酸為8.87 g/L，兩者無顯著性差異。抑制結果與模型預測的理論值大致符合，說明通過響應面試驗所建立的回歸模型預測性良好，最佳護色劑配方可行，具有實際參考價值。

3 結論

本研究分別選用6 種護色劑進行單因素試驗，通過分析褐變抑制率和色差值，發現不同護色劑對杏酒褐變的抑制效果差異較大，其中異抗壞血酸鈉的褐變抑制效果最佳。經過6 因素2 水平的正交試驗，并通過極差分析選擇對褐變抑制率和色差值影響最大的三種護色劑：異抗壞血酸鈉、L-半胱氨酸、植酸。通過采用響應面法優化護色劑配方，回歸方程擬合較好，最佳護色劑配方為：異抗壞血酸鈉0.70 g/L、L-半胱氨酸1.10 g/L、植酸0.01%。在此條件下，杏酒的酒精度為11.98%vol，還原糖為4.75 g/L，總酸為8.47 g/L，與對照組發酵的杏酒無顯著性差異，測得其褐變抑制率為53.11%，色差值為22.35，與預測值吻合率達到97.00%和95.84%。本文對杏酒護色劑的研究，為控制杏酒褐變提供了有效途徑，在今后的研究中，還可以從改善陳釀環境、加強非酶褐變的控制以及復合護色劑的互作機理等方面繼續進行探究。