石斛多糖山楂復合飲料制備及緩解運動性疲勞的作用

肖慶群

（貴州師范學院，貴州貴陽 550018）

運動性疲勞指機體在劇烈運動下，產生的大量活性氧自由基，促使氧化應激反應發生，使得體內代謝物質累積、造成組織損傷和肌肉收縮能力下降，同時體內能源物質被消耗殆盡，進一步導致工作能力與效率的降低。大量研究已證實，對機體補充外源性抗氧化劑是延緩疲勞的一種行之有效的方法[1?2]，特別是近年，部分多糖、皂苷、黃酮類化合物及小分子肽類等天然抗氧化活性成分已被發現具有顯著的抗疲勞活性[3?5]。

鐵皮石斛（Dendrobium candidum）為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛的新鮮或干燥莖，是藥食兩用植物，主要成分為石斛堿和多糖類物質，具有抗衰老、增強機體免疫等作用，常被用于保健食品的添加[6?7]。國、內外研究已表明鐵皮石斛水提物能明顯提高機體的抗疲勞及耐缺氧能力[8?10]。有學者先后分別采用水浴和微波方法提取石斛多糖，通過體外抗氧化試驗證實其對羥基自由基、超氧陰離子自由基等氧自由基清除作用較好[11?12]。由于天然化合物的體、內外活性高度相關[13]，而在石斛食品研究方面，目前多集中探討其與不同物質的復配[14?16]，卻忽略對其功能性開展研究。因此，本研究以石斛多糖和山楂為原料，研制石斛山楂復合飲料，根據動物實驗，觀察其緩解運動性疲勞效果，從而為相關運動食品的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛多糖 西安立環生物科技有限公司；山楂 貴陽恒暉綜合農貿市場；檸檬酸 濟南國丞化工有限公司；羧甲基纖維素鈉 河北利華生物科技有限公司；黃原膠 安徽中弘生物工程有限公司；海藻酸鈉 蘇州美億辰生物科技有限公司；西洋參口服液 山東鶴王生物工程有限公司；葡萄糖標準品 中國食品藥品檢定研究院；苯酚、硫酸 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；血乳酸（BLA）與血尿素氮（BUN）檢測試劑盒 上海仁捷生物科技有限公司；試驗用水 為蒸餾水；雄性健康小鼠 150 只，每只體重20～25 g，貴州實驗動物中心（SYXK（黔）2018-0001）。

BSA 124S 型電子天平 賽多利斯有限公司；Y99-IIDN 型超聲波細胞粉碎機 上海凈信實業發展有限公司；pHS-25 型pH 計 上海儀電科學儀器股份有限公司；754 型紫外可見分光光度計 上海析譜儀器有限公司；GYJZ 型高壓均質機 揚州均瑞機械設備有限公司；BKQ-B50II 型立式壓力蒸汽滅菌器 濟南歐萊博科學儀器有限公司；KH19A 型臺式離心機 湖南凱達科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 山楂汁制備 山楂曬干后，清洗干凈，以水為溶劑，在料液比1:10 條件下，于80 ℃冷凝回流2 h，采用8 層紗布過濾，收集濾液，濾渣則繼續進行上述操作，合并兩次濾液，混合均勻，減壓蒸發至200 mL，即得山楂汁[17]。

1.2.2.2 飲料配制 20%石斛多糖水溶液和20%山楂汁以一定比例混合后加入蔗糖、檸檬酸制得原料液后，另加入羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉與黃原膠（相對原料液的百分比）調配，經均質攪拌（1500 r/min）15 min 后灌裝，于121 ℃滅菌10 min，冷卻，即得石斛山楂復合飲料[15]。

1.2.3 原料液組分配比

1.2.3.1 單因素實驗 根據預實驗結果，分別研究石斛多糖溶液與山楂汁的體積比、蔗糖和檸檬酸用量對飲料中原料液的感官得分影響，具體如下：固定蔗糖用量4%，檸檬酸用量0.3%，考察石斛多糖溶液與山楂汁的體積比（5:1、3:1、1:1、1:3、1:5）對感官得分影響；固定石斛多糖溶液與山楂汁的體積比1:3，檸檬酸用量0.3%，考察蔗糖的用量（2%、4%、6%、8%、10%）對感官得分影響；固定石斛多糖溶液與山楂汁的體積比1:3，蔗糖用量4%，考察檸檬酸的用量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）對感官得分影響。

1.2.3.2 正交試驗設計 在單因素實驗基礎上，以原料液的感官評分為評價指標，對石斛多糖溶液與山楂汁的體積比（X）、蔗糖用量（Y）、檸檬酸用量（Z）三個因素進行正交試驗，以優化原料液中各組分配比，具體因素與水平見表1 所示。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3.3 飲料感官品質評價 根據石斛山楂復合飲料的特性，并參考相關飲料的評價標準[18?19]，制定該復合飲料的原料液感官評價標準，具體見表2 所示，另邀請20 位食品專業人員，分別按照該標準，對不同配比制得的原料液進行感官評價，最終評分取平均值。

表2 原料液的感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria of the raw material solution

1.2.4 復合穩定劑用量

1.2.4.1 單因素實驗 固定原料液中各組分的最佳配比，研究不同穩定劑的最佳用量具體如下：固定黃原膠用量0.06%，海藻酸鈉用量0.10%，考察羧甲基纖維素鈉的用量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）對離心沉淀率的影響；固定羧甲基纖維素鈉用量0.15%，黃原膠用量0.06%，考察海藻酸鈉的用量（0.06%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%）對離心沉淀率的影響；固定羧甲基纖維素鈉用量0.15%，海藻酸鈉用量0.10%，考察黃原膠的用量（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）對離心沉淀率的影響。

1.2.4.2 響應面試驗設計 以羧甲基纖維素鈉（A）、海藻酸鈉（B）和黃原膠（C）為響應因素，離心沉淀率為響應值（Y），設計三因素三水平的響應面試驗，利用Design-Expert 軟件的Box-Behnken 試驗設計原理，優化復合穩定劑配比，具體因素水平見表3 所示。

表3 響應面試驗因素水平Table 3 Factors and levels in response surface design

1.2.4.3 飲料穩定性評價 以離心沉淀率衡量運動飲料的穩定性，離心沉淀率越大，則溶液穩定性越差。稱取復合飲料m0，置于離心管中，以3000 r/min，離心10 min 后，對管內上清液稱重記為m，照公式W（%）=（m0–m）/ m0計算飲料的離心沉淀率W（%），平行測定六次[20]。

1.2.5 質量指標檢測 利用pH 計測定復合飲料的pH，另按照文獻[21]步驟，測定復合飲料的多糖含量，同時檢測飲料的微生物菌落總數、大腸桿菌等致病菌[22]。

1.2.6 動物實驗

1.2.6.1 動物分組與試驗設計 150 只健康雄性小鼠適應性喂養7 d 后（生長環境溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%），按體質量隨機分為五組，即空白對照組、陽性對照組、低、中、高劑量組，每組各30 只，陽性對照組給予西洋參口服液灌胃0.1 mL/g?d，低、中、高劑量組則分別灌胃復合飲料0.05、0.10、0.20 mL/g?d，而空白對照組則以0.85%生理鹽水替代飲料灌胃，全部動物每天灌胃1 次，連續灌胃30 d，灌胃期間可自由喂食與飲水[23]。

1.2.6.2 動物游泳試驗 末次灌胃后，各組10 只動物于鼠尾負重5%體重重物，置于25 ℃游泳池內開展負重游泳試驗，記錄小鼠自入水開始游泳至沉沒超過10 s 的時間，即為動物力竭游泳時間[24]。

1.2.6.3 體內生化指標檢測 末次灌胃結束后，各組剩余動物游泳30 min，取出擦凈，休息10 min 后，于眼底取血，離心，制備血清，照相關試劑盒說明書要求，檢測各組小鼠體內的血乳酸（BLA）與血尿素氮（BUN）濃度[25]。

1.3 數據處理

相關評價指標均采用均數、標準差描述，利用SPSS 19.0 進行方差分析，檢驗水準α=0.05，當P<0.05表示具有顯著性差異，P<0.01 表示具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 原料液配方單因素試驗結果

2.1.1 石斛多糖溶液與山楂汁的體積比的影響 不同石斛多糖溶液與山楂汁的體積比對原料液感官品質的影響，見圖1 所示。當石斛多糖溶液與山楂汁的體積比為1:3 時，原料液的感官得分最高，此時溶液呈淺黃綠色、透亮，酸甜適中，具有鐵皮石斛與山楂的混合香味。若山楂汁用量過多時，溶液顏色較深，影響飲料色澤觀感，感官得分偏低，因此確定石斛多糖溶液與山楂汁的體積比3:1、1:1、1:3 作為正交試驗因素考察水平。

圖1 體積比對飲料感官評分的影響Fig.1 Effect of volume ratios on the sensory evaluation of beverage

2.1.2 蔗糖用量對飲料品質的影響 蔗糖的添加有利于豐富溶液口感，不同蔗糖用量對原料液感官品質的影響，見圖2 所示。隨著蔗糖用量的增多，原料液的感官評分先增加后減小，當蔗糖用量為4%時，感官評分達到最大值，這可能歸因于蔗糖用量過多時，溶液的甜度過高，因此選擇蔗糖用量2%、4%、6%作為正交試驗因素考察水平。

圖2 蔗糖用量對飲料感官評分影響Fig.2 Effect of amount of sucrose on the sensory evaluation of beverage

2.1.3 檸檬酸用量對飲料品質的影響 檸檬酸不僅可作為食品的矯味劑、還可作為抗氧化劑和pH 調節劑，常被用于食品的添加，使其在長期存放時保持品質[26]。不同檸檬酸用量對原料液感官品質的影響，見圖3 所示。當檸檬酸用量超過0.3%，感官評分開始下降，這可能源于檸檬酸用量過多，會導致溶液澀味加重，口感變差，因此選擇檸檬酸的用量0.2%、0.3%、0.4%作為正交試驗因素考察水平。

圖3 檸檬酸用量對飲料感官評分的影響Fig.3 Effect of amountof citric acid on the sensory evaluation of beverage

2.2 原料液配方正交試驗結果

根據上述單因素實驗結果可知，石斛多糖溶液與山楂汁的體積比、蔗糖與檸檬酸用量對原料液的感官評價影響較大，但考慮單因素實驗結果并非最優值，因此設計以三者為變量的三因素三水平正交試驗，確定復合飲料的原料液最佳配比，試驗結果見表4 所示。

表4 正交試驗結果Table 4 Results of the orthogonal-test method

從表4 可知，RX>RZ>RY，即各因素對石斛山楂復合飲料的感官得分影響順序為：石斛多糖溶液與山楂汁的體積比>檸檬酸用量>蔗糖用量。通過極差分析可知，飲料原料液最佳配比為X3Y2Z3，因此采用該最優配比方案，即石斛多糖溶液與山楂汁的體積比為1:3，蔗糖用量4%，檸檬酸用量0.4%，制得原料液的感官得分為（91.2±0.5）分，此時溶液呈淺黃綠色、色澤均勻、透亮，石斛與山楂的復合香味濃郁，且酸甜適中。

2.3 不同穩定劑用量對飲料穩定性的影響

由于石斛多糖與山楂汁內仍存在纖維組織和高分子物質，因此需利用穩定劑提高溶液的穩定性。羧甲基纖維素鈉與海藻酸鈉、黃原膠復配具有較好協同增效效果，聯合應用時可顯著增加飲料的穩定性[27]，因此以上述三種物質作為復合穩定劑成分，分別考察各自對飲料的離心沉淀率影響，結果見圖4 所示。隨著不同組分用量的增多，飲料的離心沉淀率均表現為下降趨勢，但用量過多可能導致溶液粘度過大，出現凝膠，從而影響口感，因此確定分別以0.10%、0.15%、0.20%作為羧甲基纖維素鈉響應因素考察水平，0.08%、0.10%、0.12%作為海藻酸鈉響應因素考察水平，0.04%、0.06%、0.08%作為黃原膠響應因素考察水平。

圖4 復合穩定劑用量對飲料離心沉淀率的影響Fig.4 Effect of amount of compound stabilizer on centrifugal sedimentation rate of beverage

2.4 響應面優化結果

2.4.1 試驗結果 按照Box-Behnken 設計原理，分別以羧甲基纖維素鈉（A）、海藻酸鈉（B）與黃原膠（C）的用量為響應面考察因素，離心沉淀率（Y）為響應值，進行三因素三水平響應面分析，結果見表5所示。

表5 響應面試驗結果Table 5 Results of the response surface analysis

上述試驗結果進行多元回歸擬合，得到以感官得分為目標函數，各參數編碼值的二次多項回歸模型：Y=0.96?0.031A+0.074B+0.035C?0.015AB+0.053AC?0.067BC?0.038A2?0.088B2?0.055C2，對該模型進行顯著檢驗與回歸分析，結果見表6 所示。

從表6 可知，該回歸模型P<0.05，表明該模型回歸效果顯著，較好反映實際結果，R2=0.8917 顯示模型與試驗結果擬合較好，而失擬項P=0.2514 表明該模型方程不顯著（P>0.05）可準確反映試驗中各種因素與響應值之間的準確關系，可利用回歸方程擬合出最佳工藝條件。一次項B、二次項B2極顯著性影響飲料的離心沉淀率（P<0.01），而交互項AC 和BC 對其均有顯著性影響（P<0.05），另從表中F值得到，各因素對飲料的感官得分影響順序為：海藻酸鈉用量（B）>黃原膠用量（C）>羧甲基纖維素鈉用量（A）。

表6 回歸分析結果Table 6 Results of regression analysis

2.4.2 響應曲面分析與驗證試驗 圖5 為不同考察因素的交互作用對飲料的離心沉淀率影響，響應曲面越陡峭，表明離心沉淀率（Y）受不同因素的交互作用影響越大[28]，兩兩因素交互響應面坡面陡峭順序為：BC>AC>AB，即海藻酸鈉和黃原膠用量的交互作用響應面最陡峭，表明二者交互作用對飲料的離心沉淀率影響最大，另對二次多項回歸擬合方程進行極值分析，確定飲料中復合穩定劑的最佳配方為：羧甲基纖維素鈉0.20%、海藻酸鈉0.08%、黃原膠0.04%，離心沉淀率預測值為0.53%，實際測得為0.61%±0.02%。

圖5 響應曲面圖Fig.5 Figures of responsive surface

2.5 飲料質量評價

根據正交與響應面試驗確定石斛山楂復合飲料的最佳配方參數為石斛多糖溶液與山楂汁的體積比為1:3、蔗糖用量4%、檸檬酸用量0.4%、羧甲基纖維素鈉0.20%、海藻酸鈉0.08%、黃原膠0.04%。采用上述配方制得的復合飲料呈淺黃綠色、色澤均一且透亮，酸甜適中，口感爽滑，具有鐵皮石斛與山楂混合香味，靜置后未有明顯沉淀與分層，感官評分為（91.7±0.4）分。

該復合飲料的pH 為6.0；多糖含量為7.71%；微生物菌落總數≤100 CFU/ mL，未檢出大腸桿菌、黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌等致病菌，符合國家衛生標準。

2.6 飲料對動物負重游泳時間影響

負重游泳試驗常被用于考察動物的力竭運動時間，以衡量動物的運動耐力，采用該試驗分別考察各組小鼠的運動耐力，結果見表7 所示。三個劑量組與陽性對照組的動物力竭游泳時間均長于空白對照組，但中、高劑量組與其有顯著性差異（P<0.05，P<0.01），而低劑量組力竭運動時間雖有一定延長，但無顯著性差異（P>0.05），另外高劑量組仍顯著低于陽性對照組（P<0.05），表明石斛山楂復合飲料可緩解其運動疲勞，提高小鼠的運動耐力。

表7 復合飲料對小鼠力竭游泳時間的影響Table 7 Effect of mixed beverage on exhaustive swimming time in mice

2.7 飲料對體內生化指標影響

高強度運動時，耗氧量增加，體內供氧不充足，機體由有氧運動轉變成無氧運動，血糖通過糖酵解生成乳酸，使得肌肉收縮強度降低，從而導致疲勞，當運動強度加劇，體內的碳水化合物與脂肪不能提供足夠的能量時，蛋白質與氨基酸即會分解，以滿足能量需求，使得肝臟中代謝產物尿素氮濃度增大[29]，因此采用運動后體內的BLA 與BUN 濃度表示機體的疲勞程度，結果見表8 所示。

表8 復合飲料對小鼠BLA 和BUN 的影響Table 8 The effect of mixed beverageon BLA and BUN in mice

三個劑量組與陽性對照組動物的BLA 與BUN濃度均明顯低于空白對照組，其中低劑量組的BLA濃度與空白對照組相比無顯著性差異（P>0.05），而中、高劑量組與其具有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。另外，低劑量組的BUN 濃度與空白對照組相較也無顯著性差異（P>0.05），而中、高劑量組與其具有極顯著性差異（P<0.01），同時高劑量組的BLA 與BUN濃度與陽性對照組相較，有顯著性差異（P<0.05），表明石斛山楂復合飲料有利于減少運動時乳酸生成和體內蛋白質的分解。

3 結論

本研究以鐵皮石斛多糖和山楂汁為原料，研制出石斛山楂復合飲料，緩解運動性疲勞作用較好。在單因素實驗的基礎上，通過正交與響應面試驗分析確定石斛山楂復合飲料的最佳配方為：石斛多糖溶液與山楂汁的體積比為1:3、蔗糖用量4%、檸檬酸用量0.4%、羧甲基纖維素鈉0.20%、海藻酸鈉0.08%、黃原膠0.04%，所得飲料呈淺黃綠色、色澤均一且透亮，酸甜適中，口感爽滑，具有鐵皮石斛與山楂混合香味，靜置后未有明顯沉淀與分層，感官評分達到（91.7±0.4）分，離心沉淀率為0.61%±0.02%。動物實驗結果表明，石斛山楂復合飲料可明顯延長動物的力竭運動時間，通過降低運動時體內BLA 與BUN 的濃度，減少有害代謝產物的積累，從而提高運動耐力，緩解運動性疲勞的產生，因此有利于相關運動食品領域的推廣，但對該飲料在體內的具體抗疲勞機制，仍需進一步深入研究。