云南牛肝菌不同部位三種重金屬含量特征及風險評價

陳鳳霞，楊天偉，李杰慶，劉鴻高，范茂攀, ，王元忠

（1.云南農業大學資源與環境學院，云南昆明 650201；2.云南省農業科學院藥用植物研究所，云南昆明 650200；3.云南省熱帶作物科學研究所，云南景洪 666100；4.云南農業大學農學與生物技術學院，云南昆明 650201）

現代工業化發展加劇了重金屬污染，其中工業廢水、汽車尾氣排放、農藥化肥殘留、礦產資源開發成為主要污染來源[1?2]。重金屬在大氣、土壤、生物中分布廣泛，難以降解，較強的富集性、持久性和不可逆轉性使重金屬污染問題日趨嚴重[3]。重金屬通過生物鏈進入人體，與人體中蛋白質和酶發生相互作用，影響人體正常機能，此外，還能積蓄在器官中，造成慢性中毒，危害人體健康[4]。Cd、As、Pb 均被列入美國環保署（United States Environmental Protection Agency）有害空氣污染物名單。Cd 攝入過多會導致腎損害及心血管疾病[5]。美國毒物和疾病登記署（ATSDR）與國際癌癥研究機構（IARC）將Cd 歸類為第7 位危害人體健康的物質和人類致癌物。過量的As 會損害腸胃與皮膚病[6]，Pb 則會損害腦細胞，影響胎兒發育[7]。

菌類具有修復污染土壤及固體廢物、參與化合物有機質的降解與轉化的功能，具有較強的重金屬富集能力，也可用于生物監測，評價產區重金屬污染水平[8?10]。我國食用菌資源豐富，根據中國報告網及中國海關統計2019 年食用菌總產量3961.91 萬噸，出口金額達到3323947 千美元，具有較大的經濟價值。然而，國內外研究中食用菌重金屬超標問題卻屢見不鮮[11?13]。Liu 等[14]測定云南16 個地區食用菌7 種重金屬含量，結果顯示，云南食用菌重金屬污染嚴重，As、Pb、Cd 含量超出國家標準值。Sun 等[15]測定云南40 個地區8 種野生食用牛肝菌元素含量，其中包括重金屬元素Pb、Cd，結果表明，牛肝菌中Pb 元素范圍在0.41～0.70 mg/kg 之間，低于法定限值，Cd 元素在0.51～15.14 mg/kg 之間，明顯超出法定限值；灰褐牛肝菌對Cd 的富集能力較強，Cd 是牛肝菌中主要的重金屬來源。Zhang 等[16]采用電感耦合等離子體質譜法測定云南三種野生菌礦質元素含量，并對其重金屬元素As、Cd、Pb 進行健康風險評估，結果表明，部分樣品重金屬含量高于糧農組織/衛生組織食品添加劑聯合專家委員會建議的限度，云南牛肝菌科蘑菇有毒元素含量偏高。我國菌類重金屬研究較為單一，本文對牛肝菌重金屬進行了多種分析，包括子實體重金屬含量分析、污染情況和食用風險評價。

Kokkoris 等[17]測定了希臘地區6 種野生菌和土壤重金屬元素，發現蘑菇中Pb、Ni 含量較高，有毒重金屬Pb 含量范圍為2.80～8.43 mg/kg 之間，超過法定限量，存在食用潛在風險。Igbiri 等[18]對尼日利亞尼日爾三角洲地區三種食用菌重金屬進行健康風險評估，結果顯示食用菌中重金屬含量超過規定攝入量，Ni 含量超標，具有一定致癌風險。Schlecht 等[19]測定了德國柏林地區野生食用菌中重金屬元素Cd、Pb 含量，結果表明，大部分野生蘑菇樣品中兩種重金屬含量均超過歐盟標準。在相關菌類重金屬研究文獻中，研究人員對菌類重金屬含量及影響進行了大量的研究分析，但卻忽略了不同污染評價方法和國家相關標準導致結果的差異性。本文中的研究內容分析角度全面，彌補了以往研究中的不足，較為新穎。

測定云南9 種牛肝菌不同部位有毒重金屬As、Cd、Pb 含量，利用單因子污染指數、內梅羅綜合污染指數和相關限量標準評價牛肝菌重金屬污染與健康風險，以期為云南牛肝菌資源開發與消費者合理膳食提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰褐牛肝菌（A）40 份、美味牛肝菌（B）60 份、皺蓋疣柄牛肝菌（C）40 份、磚紅絨蓋牛肝菌（D）26 份、絨柄牛肝菌（E）47 份、金黃柄牛肝菌（F）19 份、灰疣柄牛肝菌（G）17 份、紅疣柄牛肝菌（H）20 份、黑絨蓋牛肝菌（I）21 份。牛肝菌共計290 份，采自于云南各個地區，詳情見圖1 和表1，均由云南農業大學劉鴻高教授進行品種鑒定。將不同種類不同地區的牛肝菌樣品進行分類，使用陶瓷刀去除表面雜物及泥土，自來水清洗干凈后用蒸餾水潤洗三遍。菌蓋與菌柄分開置于烘箱中50 ℃烘干至恒重。粉碎后過100 目標準篩，置于自封袋備用；65% HNO3、30%H2O2廣東西隴化工股份有限公司；茶葉標準物GBW07605 地礦部物化探研究所；元素標準儲備液 濟南眾標科技有限公司；超純水（電阻率>18.25 MΩ.cm）。

圖1 云南省牛肝菌采樣點示意圖Fig.1 Sketch map of Boletaceae sampling points in Yunnan Province

表1 9 種牛肝菌樣品代號及產地Table 1 Sample code and origin of 9 boletus mushroom samples

ICPE-9000 電感耦合等離子體原子發射光譜儀 日本島津公司；FW-100 型高速粉碎機 天津市華鑫儀器廠；101A-1 型電熱鼓風恒溫干燥箱 上海崇明實驗儀器廠；Mars6 微波消解儀 美國CEM 公司；UPT-I-10 超純水機 優譜科技有限公司；奧豪斯電子分析天平 Ohaus 儀器有限公司；100 目不銹鋼篩盤 浙江上虞市道墟五四儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛肝菌重金屬元素測定 每份樣品粉末準確稱取300 mg 置于微波消解罐，加入5 mL HNO3與3 mL H2O2微波消解儀進行消解，微波消解條件設置為4 步驟，功率和升溫時間均為1500 kW 與5 min，溫度設置分別為120、150、170、180 ℃。消解完畢冷卻并使用超純水定容25 mL，搖勻澄清待測。相同方法消解茶葉標準物，制備空白對照，使用HNO3將各元素標準儲備液配制成0.00、0.02、0.05、0.10、0.50、1.00 μg/mL 建立元素標準曲線。

1.3 牛肝菌重金屬污染評價

內梅羅（Nemero）綜合污染指數法主要用于評估水質、土壤、食品重金屬污染水平，也是常見的污染評價方法[20?21]。單因子污染指數分級標準為：Pi≤1無污染、13 重污染。內梅羅綜合污染指數分級標準為：Psum≤0.7安全，清潔、0.73 重污染，受到嚴重污染。本文采用單因子污染指數法和內梅羅（Nemero）綜合污染指數法對每種牛肝菌樣品進行重金屬污染評價。

其污染指數計算公式如下[22?23]：

注：公式（1）中Pi為牛肝菌中重金屬i 的污染指數；Ci為牛肝菌重金屬i 的實測濃度；Si為牛肝菌重金屬i 的評價標準值（根據《GB2762-2017 食品安全國家標準 食品中污染物限量》）。公式（2）中Psum為某產地牛肝菌綜合污染；表示牛肝菌中重金屬i 單因子污染指數平均值；Pimax表示牛肝菌中重金屬i 的污染指數最大值。

1.4 牛肝菌的潛在健康風險評估

2010 年FAO/WHO JECFA 取消了原先制定的Pb 暫定每周可耐受攝入量25 μg/kg 與As 每周最大耐受攝入量0.015 mg/kg，并認為人體對Pb、As 暴露量越低越好，無法確定限量標準對人體健康進行有效保護。考慮到數據分析的局限性，本研究仍采用2010 年之前對于Cd、Pb、As 的每周可耐受攝入限量標準，分別為：Cd≤0.007 mg/kg、As≤0.015 mg/kg、Pb≤0.025 mg/kg。

所有數據采用Microsoft Excel 2014 軟件初步整理后運用SPSS18.0 進行描述統計與相關性分析，采用目標危害系數法（THQ）計算攝入風險。其風險評估計算相關公式為[24]：

注：公式（3）中THQi為重金屬i 的目標危害系數；BW 為消費者體重（60 kg）；ED 為牛肝菌暴露年限（70 年）；EFR為牛肝菌暴露頻率（365）；FIR為牛肝菌日攝入量；AT 為牛肝菌平均作用時間（ED×365）；Ci為牛肝菌中重金屬i 濃度；RfD 為重金屬每日最大耐受攝入量標準；TTHQ 為綜合目標危害商數。

1.5 數據處理

在元素含量測定中，每個樣品重復三次，每測定三個樣品進行一次空白試驗對照用于減少儀器的不穩定性以減少誤差。元素數據使用Excel 2007 進行數據統計整理，采用Epess Statics 20 單因素方差分析法對數據進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 元素測定方法準確性分析

如表2 所示，三種元素Cd、Pb、As 測定波長分別為214.438、220.353、189.042 nm，檢出限0.0104、0.1243、0.5634 μg/L。樣品元素回收率在105%、95%、93.1%，標準物元素測定值與標準值非常相近，分別在0.060 與0.057 mg/kg、4.2 與4.4 mg/kg、0.283 與0.280 mg/kg，說明此方法準確可靠。

2.2 不同部位牛肝菌Cd、Pb、As 含量分析

牛肝菌味道鮮美，富含多種維生素和礦質元素，但牛肝菌對重金屬也具有較強的富集能力，重金屬超標會使人體健康受到影響。牛肝菌菌蓋、菌柄中重金屬含量及重金屬比值見表3。牛肝菌菌蓋Cd、Pb、As 含量在0.36～20.89 mg/kg、0.21～4.42 mg/kg、0.26～13.33 mg/kg 之間。牛肝菌菌柄Cd、Pb、As 含量在0.07～19.91 mg/kg、0.59～18.48 mg/kg、0.29～17.10 mg/kg 之間。牛肝菌不同部位對重金屬的吸收存在差異性。對相同種類、部位不同產地牛肝菌進行差異性分析，發現大部分牛肝菌重金屬含量具有顯著性差異（P<0.05），牛肝菌對重金屬元素的富集可能與產地有關。Schlecht 等[19]測定了德國柏林地區野生食用菌中重金屬元素Cd、Pb 含量，結果表明，大部分野生蘑菇樣品中兩種重金屬含量均超過歐盟標準。我國規定了食品中污染物限量（GB2762-2017），食用菌及其制品中有毒重金屬元素限量分別為Cd≤0.5 mg/kg、Pb≤1.0 mg/kg、As≤0.5 mg/kg。表3 中部分牛肝菌樣本Cd、Pb、As 含量超標，牛肝菌菌蓋Cd、Pb、As 超標率為91.43%、77.14%、82.86%；菌柄Cd、Pb、As 超標率分別為68.57%、77.14%、82.86%，相同部位不同品種的牛肝菌重金屬元素含量差異明顯，大部分牛肝菌菌蓋重金屬大于菌柄。Cd 在牛肝菌菌蓋中的超標率遠大于菌柄，這與Zhang 等[25]對美味牛肝菌不同部位礦質元素的研究結果一致。比較不同部位重金屬元素含量（Q（c/s））可知，91%的牛肝菌Cd 含量菌蓋大于菌柄。60%的牛肝菌Pb 含量菌柄大于菌蓋。51%的牛肝菌As 含量菌蓋大于菌柄。此結果表明Cd、As 更易富集在牛肝菌菌蓋，Pb 易富集在牛肝菌菌柄。

表2 茶葉標準物（GBW 07605）礦質元素含量及檢出限Table 2 Mineral elements contents in tea standard（GBW 07605）and limits of detection

表3 云南牛肝菌中有毒重金屬含量及菌蓋與菌柄含量之比（mg/kg dm）Table 3 The content of toxic heavy metals in Boletaceae in Yunnan and the ratio of the content of the cap to the stipe (mg/kg dm)

2.3 牛肝菌重金屬污染評價

菌類具有較強的重金屬富集能力，研究菌類重金屬污染問題可為了解產區重金屬污染狀況、優化環境，合理資源開發提供借鑒意義。大部分牛肝菌樣品重金屬污染狀況嚴重，牛肝菌中相同部位不同種類，相同種類不同部位的污染程度具有差異。從單因子污染指數來看，處于輕度污染與重度污染的樣品數較多。Cd 在牛肝菌中超標率最高，其次是Pb 和As。根據表4 可知，重度污染且超過50%的牛肝菌菌蓋樣品有絨柄牛肝菌66%（As）、灰褐牛肝菌100%（Cd）、美味牛肝菌65%（Cd）、金黃柄牛肝菌52.6%（Cd）。無污染且超過50%的牛肝菌菌蓋樣品有灰褐牛肝菌62.5%（As）、絨柄牛肝菌53.1%（Cd）；灰褐牛肝菌67.5%（Pb）；磚紅絨蓋牛肝菌57.7%（Pb）；金黃柄牛肝菌52.6%（Pb）。

表4 牛肝菌污染程度占比（%）Table 4 Proportion of pollution degree of Boletaceae(%)

Pb 重度污染率最高為灰疣柄牛肝菌（70.6%）菌柄與紅疣柄牛肝菌（65%）的菌柄，而菌蓋重度污染率僅僅為0%和5%。多數樣品Pb 重度污染率菌柄高于菌蓋，也就說明菌柄比菌蓋更易富集Pb。處于重度污染且超過50%的牛肝菌菌柄樣品有絨柄牛肝菌66%（As）、灰褐牛肝菌100%（Cd）、灰疣柄牛肝菌70.6%（Pb）、紅疣柄牛肝菌60.5%（Pb）。絨柄牛肝菌和灰褐牛肝菌的菌柄菌蓋重度污染率均為66%與100%。表5 中灰褐牛肝菌Cd 的Pi最高，為73.53，超出重污染最低限制的24.51 倍，屬于重度超標，牛肝菌受不同重金屬污染程度具有差異性，可能與牛肝菌對不同重金屬的富集能力有關。內梅羅綜合污染指數分級標準為：Psum≤0.7 安全，清潔、0.73 重污染，受到嚴重污染。梅羅綜合污染指數結果顯示，金黃柄牛肝菌菌蓋菌柄的As-Psum值最小（1.79、1.82）；其次是灰褐牛肝菌（1.86、2.56），它們的梅羅綜合污染指數相對較低，屬于輕度污染與中度污染之間。灰褐牛肝菌菌蓋菌柄的Cd-Psum值（55.12、28.16）與灰疣柄牛肝菌的Cd-Psum值（31.45、52.56）屬于嚴重污染。皺蓋疣柄牛肝菌菌蓋菌柄的Pb-Psum值最大（6.49、24.96），屬于嚴重污染。金黃柄牛肝菌菌柄的Pb-Psum值最小（1.47），屬于輕度污染。研究結果顯示，不同種類牛肝菌中均有超標現象，其中Cd 是牛肝菌重金屬污染的主要特征污染元素。

表5 牛肝菌單一污染指數和內梅羅綜合污染指數的統計表Table 5 Statistical table of Boletaceae single pollution index and Nemero comprehensive pollution index

2.4 不同部位牛肝菌膳食健康風險評價

根據聯合國糧農組織和世界衛生組織食品添加劑聯合專家委員會（FAO/WHO JECFA）推薦的暫定每周可耐受攝入量（Provisionally tolerable weekly intake，PTWI）結合目標危害商數對不同種類牛肝菌進行膳食健康風險評價。假設一個60 kg 的成年人每周攝入300 g 新鮮牛肝菌，則根據公式（3）（4）計算出不同種類牛肝菌的單一重金屬目標危害商數（THQ）和綜合目標危害商數（TTHQ）。由表6 可知，食用牛肝菌均有攝入重金屬危害人體健康的風險。通過牛肝菌目標危害商數分析可知，除了磚紅絨蓋牛肝菌菌柄與絨柄牛肝菌菌柄的Cd-THQ<1，其他種類牛肝菌的Cd-THQ>1。菌蓋Cd-THQ>1 的比例為100%。菌柄Cd-THQ>1 的比例為78%，范圍在0.597～18.157 之間，最小值與最大值相差30 倍。Cd 在牛肝菌綜合健康風險中占比最大，城市密集地區蔬菜重金屬污染研究中也發現Cd 更易富集在蔬菜里[22]。牛肝菌菌蓋As-THQ、Pb-THQ 范圍為0.464～6.499、0.580～7.957。牛肝菌菌柄As-THQ、Pb-THQ 范圍在0.520～1.281、0.470～3.282 之間，牛肝菌具有不同程度重金屬攝入風險。如表6 所示，9 種牛肝菌綜合目標危害商數（TTHQ）大于1，不同重金屬的THQ 對綜合健康風險的貢獻率具有差異。總體來說，攝入牛肝菌的重金屬健康風險較大，建議消費者適量食用。

表6 不同種類牛肝菌的單種重金屬目標危險度（THQQ）和總目標危險度（TTHQ）Table 6 Target hazard quotient (THQ) of single heavy metal and totaltarget hazard quotient (TTHQ)of different species of Boletaceae

3 結論

本試驗采用ICP-MS 法測定云南省9 種牛肝菌重金屬含量，分析元素含量特征、差異性及富集特點，結合GB2762-2017 與FAO/WHO 相關限量標準對牛肝菌進行重金屬污染評價和膳食暴露風險。結果表明，牛肝菌中As、Cd、Pb 均有不同程度超標，Cd 是牛肝菌主要的有毒重金屬來源，牛肝菌菌蓋對Cd 的富集較多，而Pb 更易富集在牛肝菌菌柄中。單因子污染指數與內梅羅綜合污染指數顯示，處于輕度污染與重度污染的樣品數較多，Cd 是牛肝菌重金屬污染的主要特征污染元素。健康風險評價結果表明，所測牛肝菌綜合目標危害商數均大于1，且數值較大，大量食用牛肝菌有攝入重金屬危害人體健康的風險。牛肝菌是一種常見的野生食用菌，具有較大的食用價值和經濟價值，對云南牛肝菌重金屬進行分析，有利于當地資源合理開發利用，也為消費者提供合理的膳食依據。本研究在食用菌重金屬污染控制問題方面尚難以解決，對于野生菌類進行人工馴化栽培，減少子實體重金屬富集將是今后研究的重要方向。