羅伊氏乳桿菌對發酵魚糜揮發性風味物質的影響

江 鋒，鄭心茹，周常義，江曉穎，林偉言，劉 玉，蘇文金，蘇國成,

（1.廈門中集信檢測技術有限公司，福建廈門 361100；2.集美大學食品與生物工程學院，福建廈門 361021）

發酵食品由來已久，具有獨特風味、豐富營養和耐保藏等特色，是廣受歡迎的食品[1]。其中發酵水產品近年來逐漸受到關注，應用生物發酵技術對傳統魚糜制品、魚塊、全魚等進行了廣泛研究。國內外學者研究發現在魚糜制作過程中添加有益微生物，不僅能抑制葡萄球菌、假單胞菌等雜菌的生長，減少生物胺的積累，還能增強魚糜制品的凝膠強度，碳水化合物與脂肪降解后產生的有機酸、醇、酮等化合物可以去除魚肉的土腥味，賦予魚糜制品特殊的發酵香氣[2?3]。

目前國內外對食品中揮發性成分的研究常采用同時蒸餾萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）、溶劑萃取、固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）、超臨界萃取等提取技術及氣相色譜、氣相色譜-質譜聯用（Gas Chromatograph-Mass Spectrometry，GC-MS）、飛行時間質譜（TOFMS）、電子鼻等分析鑒定技術[4]。SDE 法利用相似相溶原理，對揮發物進行富集。龍斌等[5]采用SDE 法對樣品中揮發性風味成分進行提取，從川鯰腹肉和背肉中分別檢測出67 和45 種揮發性風味成分。Forehand等[6]采用SDE 法提取豆醬中揮發性物質，用DBwax 色譜柱進行洗脫分離，鑒定出了91 種揮發性物質。Kesen 等[7]采用蒸餾萃取法提取橄欖油中揮發性物質，用二氯甲烷做溶劑，并用DB-wax 色譜柱進行芳香物質的分離，每種樣品分離鑒定出12～14 種主要的芳香成分。劉佳等[8]采用固相微萃取對鮮牡蠣肌肉風味化合物進行了濃縮，并用HP-5MS 彈性毛細管色譜柱進行風味物質的分離，檢出了24 種呈味物質，主要是醛類、酸類、醇類、烯類等化合物。

本研究采用篩選出的適宜魚糜發酵的優良菌株接種到魚糜中進行發酵，探索其產生風味物質的變化規律。根據前期的實驗基礎，利用已分離篩選具有降解亞硝酸鹽能力的羅伊氏乳桿菌[9]，加入到魚糜中制作發酵魚糜，采用SDE 法結合GC-MS 技術檢測發酵魚糜的揮發性風味物質，比較自然發酵魚糜與羅伊氏乳桿菌法加工發酵魚糜的風味物質變化，以期為開發新型發酵魚糜制品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金線魚魚糜 AAA 級，福建泉州龍富港水產品有限公司；羅伊氏乳桿菌R6 本實驗室分離保存菌株；MRS 固（液）體培養基 廣東環凱生物科技有限公司；乙醚 優級純，國藥集團；Na2SO4分析純，國藥集團。

PHX150 生化培養箱 寧波萊福科技有限公司；Bag Mixer 400VW 均質器 法國INTERSCIENCE公司；TP-1102/214 電子分析天平、PB-10 pH 計 德國賽多利斯公司；500 mL 同時蒸餾萃取設備 廈門市集美區仕富玻璃廠；Varian320-MS 氣相色譜-質譜聯用儀 美國Varian 公司；OA-SYS 氮吹儀 美國Organomation 公司；RE-52AA 旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 自然發酵魚糜：將冷凍魚糜解凍后，將水分調整為80%，空擂5 min，按魚糜質量添加3%食鹽和適量淀粉，繼續擂潰10 min。擂潰過程中控制魚糜樣品溫度不超過10 ℃[10?11]。30 ℃放置30 h，45 ℃水浴1 h 后轉移至90 ℃水浴20 min，加熱完成后立即置于冰水浴中冷卻，在4 ℃冰箱冷藏過夜。

乳酸菌法發酵魚糜[9,12]：以羅伊氏乳桿菌R6 為發酵劑，在食鹽擂潰前按1%的接種量接種菌株R6（108CFU/mL），其余步驟與自然發酵法相同。

1.2.2 揮發性風味物質的富集 在SDE 裝置右側的燒瓶中加入稱取10 g 已發酵樣品，加入200 mL 蒸餾水。在SDE 裝置左側的燒瓶中加入重蒸后的乙醚50 mL。打開冷卻水，將電熱套設置為110 V，加熱試樣燒瓶；將水浴溫度設定為50 °C 以加熱溶劑瓶，當兩邊稍微煮沸時，提取2 h。提取完成后，首先關閉電熱套和水浴的電源，等待冷卻，然后關閉冷卻水。冷卻后，收集U 形管中的溶劑并合并到含溶劑的蒸餾瓶中。提取完成后，將200 mL 蒸餾水加入到樣品瓶中，并將50 mL 再蒸發的乙醚加入到溶劑瓶中，然后根據上述用于添加樣品的提取方法進行30 min 的提取。向合并的提取物中加入適量的無水Na2SO4，在冰箱中冷凍過夜并過濾。將提取物在減壓下蒸餾至5 mL，然后用氮吹儀將氮氣吹至0.5 mL。過膜裝入小瓶中，并通過氣相色譜-質譜法分析濃縮物[13]。

1.2.3 GC-MS 分析方法 色譜和質譜條件根據參考文獻和預實驗條件進一步優化[7,13]。

色譜條件：色譜柱使用VF-17ms 毛細管柱（30 m，0.25 mm，0.25 μm）；入口溫度：250 °C；升溫步驟：在35 ℃保持1 min，以5℃/ min 升溫至60℃保持1 min，6 ℃/ min 升溫至140℃ 保持1 min，最后8 ℃/min升溫至230 ℃保持5 min；載氣：氦氣；流速1.0 mL/min；恒速，分流比1:20。

質譜條件：離子源溫度：200 ℃，電子能量70 eV，質量掃描范圍35～350 m/z，無溶劑去除時間。

1.3 數據處理

數據處理和質譜檢索：通過質譜儀工作站，運用NIST 譜庫檢索人工比對對GC-MS 采集得到的質譜數據進行檢索。通過面積歸一化法分析每個組分的相對含量。顯著性水平設為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 發酵魚糜的揮發性物質總離子流圖

采用同時蒸餾萃取法分離，提取和濃縮各樣品中揮發性物質，并結合GC-MS 檢測法在上述條件下分析自然發酵魚糜和乳酸菌法發酵魚糜的風味物質變化。圖1 和圖2 顯示了兩種發酵方式魚糜樣品的總離子色譜圖。乳酸菌法發酵魚糜的總離子強度比自然發酵魚糜的總離子強度高，而且產生的物質相對更多。

圖1 自然發酵魚糜總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow diagram of naturally fermented surimi

圖2 乳酸菌發酵魚糜總離子流色譜圖Fig.2 Total ion flow diagram of fermented surimi by lactic acid bacteria

2.2 不同方式發酵后魚糜風味物質含量和分析

搜索數據庫分析，取大于80%以上相似度的揮發性風味物質鑒定出樣品魚的不同揮發性成分，結果見表1 和圖3。可以看出，發酵魚糜的主要揮發性成分中的51 個組分是飽和或不飽和的醛類、酯類、醇類、烴類和其他物質。在乳酸菌法發酵魚糜中檢測到37 種揮發性化合物，在自然發酵魚糜中檢測到25 種揮發性物質。這兩種不同的發酵方式在主要呈味成分種類以及含量方面有一定的區別。乳酸菌法加工發酵魚糜中醛類、醇類的數量較多，相對含量較高，這與自然發酵方法的樣品有所區別，也許與乳酸菌的蛋白酶和脂肪酶加速蛋白質和脂肪的分解，產生大量的游離氨基酸和脂肪酸，并形成獨特的揮發性物質有關[14?17]。

表1 發酵魚糜揮發性成分的GC-MS 分析結果Table 1 GC-MS analysis of volatile components from fermented surimi

續表 1

圖3 發酵魚糜中揮發性化合物的種類及相對含量Fig.3 Composition and relative content of compound classes in fermented surimi

我國已批準羅伊氏乳桿菌可作為人類保健品的微生物菌種，該菌具有很高的理論研究和生產應用價值[16]。在動物飼料、食品等方面有較多關于羅伊氏乳桿菌應用的研究報道，添加羅伊氏乳桿菌對于產品的感官、風味、品質的提升有一定作用[17?18]。

本研究中比較了羅伊氏乳桿菌發酵魚糜與自然發酵魚糜中揮發性風味物質的區別，在兩種發酵魚糜中，羅伊氏乳桿菌法發酵魚糜揮發性物質中酯類、酸類和烷烴類物質含量明顯高于自然發酵魚糜，含量分別是自然發酵魚糜中占揮發性物質的1.20%和2.72%和1.56%，乳酸菌發酵魚糜中占揮發性物質的21.83%、14.86%和14.98%；羅伊氏乳桿菌法發酵魚糜中醇類稍高于自然發酵魚糜，分別為16.37%和11.35%；自然發酵魚糜的酮類和醛類略高于羅伊氏乳桿菌法發酵魚糜，前者的酮類和醛類分別為4.51%和15.93%，后者分別為1.69%和11.69%。

近年來，在發酵酸魚方面有一系列研究報道，例如Xu 等[14]采用植物乳桿菌、木糖葡糖球菌和釀酒酵母混合菌發酵酸魚，發現在發酵過程中，醛類、酸類、醇類、酯類、酮類的含量在不斷增加。Zang 等人[15]在低鹽酸魚發酵方面的研究表明，添加的菌種對產生磷脂分子種類有影響，其中接種了釀酒酵母和混合發酵劑的酸魚，產生的磷脂分子比未添加釀酒酵母多。臧金紅[19]采用混合接種對鯉魚進行發酵，篩選出9 中酸魚特征風味物質，分別為乳酸乙酯、十六酸乙酯、苯甲醛和異戊酸等化合物，發現這些物質與關鍵微生物的演替有關。這些研究表明發酵產品風味的形成與所添加的菌種有相關性，這與本研究的結果相似。

2.2.1 酯類化合物 酯類化合物是常見的揮發性風味成分，由于較低的氣味閾值，檢出酯類可以賦予制品果香味[20]。本研究中，乳酸菌發酵魚糜相對于自然發酵的魚糜酯類的含量大幅度提高，風味明顯優于傳統發酵魚糜。其中在乳酸菌發酵魚糜中含量較高的乙酸乙酯、乙烯乙酯、甲酸乙酯、異戊酸乙酯等在自然發酵的魚糜中均未檢出，其中乙烯乙酯的含量達10.24%。

高沛[21]研究微生物與酸魚中揮發性物質的關系，比較了植物乳桿菌、木糖葡糖球菌和釀酒酵母單一菌株分別接種魚體發酵和自然發酵的方法，結果表明，接種乳酸桿菌組的脂類物質含量最高，乙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯等是酸魚的關鍵氣味成分。與本研究中乳酸菌發酵魚糜的脂類物質大量增加有類似情況。

2.2.2 酸類化合物 在傳統的發酵魚肉腸中，酸類物質含量很低，碳原子數小于六的為短鏈的脂肪酸，它具有強烈的酸度和香氣，對風味影響很大[22]。低價值的魚肉酸味和奶酪味道主要是由于這些酸的增加。它們除了主要來源于氨基酸的代謝，還可能來自碳水化合物的分解。吳海燕等[23]在研究發酵劑對咸魚的影響發現乙酸、丁酸、異丁酸和戊酸的濃度隨著發酵時間的增加而逐漸增加。在本研究中，自然發酵魚糜的乳酸菌發酵的魚糜中酸類物質含量分別為2.72%和14.86%，可見酸類物質顯著提高，乳酸菌發酵魚糜中乙酸、2-乙基丁酸、硫代乙酸含量明顯高于自然發酵魚糜，乳酸菌發酵魚糜的酸味和奶酪味明顯優于自然發酵魚糜，這也許是因為羅伊氏乳桿菌為異型乳酸發酵，而且在代謝過程中，產生乳酸、乙酸等不同酸類物質，同時與乳酸菌分解蛋白質，產生多種代謝產物有關系。

2.2.3 醇類化合物 在本研究中檢出正己醇、1-辛烯-4-醇、1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇等醇類化合物，為主要的風味物質。自然發酵魚糜中檢出4-甲基-1-戊烯-3-醇、3-甲基-2-丁醇、2-戊醇、3-十六醇，而乳酸菌法發酵魚糜中未檢出這些物質；乳酸菌法發酵魚糜中檢出1-戊烯-3-醇、正己醇、異十三醇、環十二醇，但在自然發酵魚糜中未檢出這些物質。乳酸菌法發酵魚糜中1-辛烯-3-醇、1-辛烯-4-醇、3-甲基-1-丁醇的含量低于自然發酵魚糜。醇類的分子結構會影響其香氣強度、特征和類型。低級脂肪醇指7 個碳原子以內的醇，一般沒有什么特殊的香氣，當碳原子數增加到12 時，呈現出比較特別的香氣，但當醇的碳原子數高于12 時香氣又會消失不見[21]。1-辛烯-3-醇對發酵樣品中的醇類對肉類風味的形成有一定作用，具有蘑菇香氣和類似的金屬味，是日本 fish miso和臭鮭魚的關鍵風味之一[24?25]。有研究認為1-辛烯-3-醇與鮮魚的腥味有關[19]，本研究中通過添加羅伊氏菌發酵，該物質含量降低，魚腥味有一定減緩作用。1-戊烯-3-醇香氣特征是果香和蔬菜香[21]。羅伊氏乳桿菌發酵生產醇類物質的來源除了與碳水化合物分解有關外，還可能通過脂類代謝途徑產生[26]。

2.2.4 醛酮類物質 本研究中兩種發酵魚糜中，自然發酵法中揮發性物質醛類和酮類物質均高于乳酸菌發酵魚糜，其中，正己醛含量分別為13.53%和8.16%，2-甲基-3-戊酮含量分別為3.74%和未檢出。醛類的閾值較低，賦予食物清香和果香的芳香特質，其風味取決于醛的濃度。魚的主要揮發性風味化合物是羰基化合物。N-己醛在淡水魚和海水魚中均有，具有青草味，它通常與C8-揮發性化合物混合并有助于魚的香氣[27]。在發酵過程中，醛類化合物可以通過脂質過氧化或降解產生，也可以通過氨基酸降解或醛酸途徑產生。本研究中兩種發酵魚糜均檢出的具有青草味的是正己醛，且含量相對較高；自然發酵魚糜中檢出苯甲醛，有特殊的杏仁氣味，這些物質對于產品的風味有一定作用。酮類物質通常是脂肪氧化和美拉德反應的產物，酮類物質具有清香味、奶油味和果香味。酮類物質閾值一般比醛類物質高，本研究中檢測出的酮類物質含量和種類均較少，推測對發酵魚糜氣味的貢獻較小。

2.2.5 其他化合物 烴類化合物主要來源于脂肪酸烷氧自由基的均裂[28]，有學者認為對魚露的溶劑味有貢獻的是一些烷基苯和支鏈烷基[22]。在本研究中檢測到的一定含量烷烴，由于烷烴的閾值較高[29]，預計這些物質對產品整體風味貢獻不大的。

3 結論

通過比較不同方法發酵魚糜的風味物質發現，醛類、醇類和酮類是構成發酵魚糜獨特風味的主要成分。本研究添加羅伊氏乳桿菌發酵的魚糜中檢測到總共37 種具有不同風味特征的物質，主要特征物質有乙酸、正己醛、1-辛烯-3-醇和乙酸乙酯等。自然發酵魚糜中共檢出25 種揮發性物質。羅伊氏乳桿菌法發酵魚糜中酯類、酸類、烷烴類和醇類物質含量均高于自然發酵魚糜。乳酸菌法發酵魚糜提高了魚肉感官品質，產品具有特殊的風味，因此采取乳酸菌法發酵魚糜的加工方法不僅有利于縮短加工時間，而且增強產品的獨特風味，使產品質量明顯提高。

在揮發性物質萃取方面，本研究采用SDE 法，后續研究可考慮采用HS-SPME 或其他方法進行萃取；在檢測設備方面，本研究采用GC-MS 方法，今后可結合GC-O、電子鼻等設備，更全面分析發酵魚糜中揮發性物質；在研究方法方面，可結合代謝組學方法研究其代謝通路，以更全面了解發酵魚糜的揮發性化合物的產生機制。