TG-DHA 脂質(zhì)體對高脂飲食小鼠食欲的調(diào)節(jié)作用

楊瑞利，劉 芳，張 慧，周賽楠，王志廣，盧 娜，唐慶娟

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003）

隨著居民生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的不斷變化，中國人的超重率和肥胖率日益上升[1]。2016 年英國著名醫(yī)學(xué)雜志《柳葉刀》發(fā)表的關(guān)于全球成年人體重調(diào)查報(bào)告顯示：中國肥胖人群已突破9000 萬，超越美國成為全球肥胖人口最多的國家[2]。由肥胖帶來的一些并發(fā)癥：高血壓病、糖尿病、脂代謝紊亂、心臟病、惡性腫瘤等嚴(yán)重危害著人類的健康[3]。近年來，改善肥胖的方式主要有飲食調(diào)整，藥物、手術(shù)治療，體育運(yùn)動(dòng)干預(yù)等[4]。而飲食調(diào)控成為了近些年全世界關(guān)注的焦點(diǎn)[5]。

下丘腦是控制食物攝入和能量平衡的神經(jīng)中樞，可以接受整合外周激素和腦-腸軸傳遞的信號(hào)，發(fā)放到效應(yīng)器官，從而促進(jìn)或抑制攝食[6?7]。瘦素和胰島素是參與食欲調(diào)控最主要的兩種外周激素。瘦素是一種由脂肪組織分泌的蛋白類激素，可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)肽Y（Neuropeptide Y，NPY）和阿黑皮素原（Proopiomelanocortin，POMC）的的合成和釋放，從而抑制食欲[8]。胰島素是有胰島β細(xì)胞產(chǎn)生，調(diào)節(jié)食欲的機(jī)制與瘦素相似[9]。腦-腸肽包括促進(jìn)食欲的腦-腸肽促生長素（ghrelin）和抑制食欲的腦-腸肽膽囊收縮素（Cholecystokinin，CCK），肽YY（Peptide YY，PYY），胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）[10]。腦-腸肽可以通過迷走傳入神經(jīng)元將信號(hào)傳遞給下丘腦調(diào)節(jié)食欲，或者通過血腦屏障，直接作用于下丘腦中的特異性受體，從而調(diào)節(jié)食欲[11?12]。二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）屬于n-3 多不飽和脂肪酸，具有降脂減肥，控制食欲，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)腸道菌群等功效[13]。劉新麗等[14]的研究表明n-3 多不飽和脂肪酸可以減少肥胖小鼠NPY、POMC 等食欲調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。Golub 等[15]的研究表明，膳食補(bǔ)充DHA 會(huì)影響食欲或攝食量的調(diào)節(jié)。江亞娟[13]的實(shí)驗(yàn)也表明N-3 多不飽和脂肪酸改善能量代謝，控制小鼠體重可能與調(diào)控小鼠飲食相關(guān)神經(jīng)肽基因和解耦聯(lián)蛋白UCP 的表達(dá)有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)DHA 可以通過食欲改善高脂飲食小鼠體脂蓄積。由于DHA 屬于多不飽和脂肪酸，具有6 個(gè)雙鍵，極易受光、熱的影響，同時(shí)極易發(fā)生氧化和酸敗。來源于魚油和藻油的DHA 多為甘油三酯型（Triglyceride，TG），尤其是魚油中TGDHA 含量較為豐富，但其帶有令人難以接受的魚腥味。限制了其在食品工業(yè)領(lǐng)域的開發(fā)利用。因此人們采用多種方式對它進(jìn)行保護(hù)。脂質(zhì)體作為一種新型微膠囊包埋技術(shù)，由于其兩親性，較高的生物相容性，穩(wěn)定性等受到廣泛關(guān)注[16]。很多文獻(xiàn)都曾報(bào)道，脂質(zhì)體可以掩蓋魚油腥味[17]。楊梅等[18]的研究表明高磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine，PC）的磷脂更適合作為制備脂質(zhì)體的壁材。目前的研究主要集中在魚油脂質(zhì)體的制備，關(guān)于其對食欲調(diào)控的研究相對較少，這在很大程度上限制了魚油產(chǎn)品的開發(fā)利用。

本實(shí)驗(yàn)以98%的PC 為壁材制備TG-DHA 脂質(zhì)體，探究TG-DHA 脂質(zhì)體對高脂飲食小鼠食欲調(diào)節(jié)因子表達(dá)的影響，為開發(fā)相關(guān)的高附加值產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10/70 TG-DHA 金槍魚油 浙江舟山新諾佳生物技術(shù)有限公司；98%大豆磷脂酰膽堿（98% PC） 西安艾諾醫(yī)藥科技有限公司；SPF 級(jí)6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠 濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司；瘦素（Leptin）試劑盒、胰島素（Insulin）試劑盒、阿黑皮素原（Proopiomelanocortin，POMC）試劑盒 蘇州卡爾文生物科技有限公司；TRIZOL 試劑 美國Invitrogen 公司；RNA 純化試劑盒 天根生化科技有限公司；5X All-In-One RT 裂解反轉(zhuǎn)錄一體試劑盒、EvaGreen Express 2X qPCR MasterMix 加拿大abm 公司；10%低脂飼料（飼料代碼TP23522）、45%高脂飼料（飼料代碼TP23220） 南通特洛菲飼料科技有限公司，飼料配方見表1；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1 飼料配方Table 1 Feed formula

DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海力辰邦西儀器科技有限公司；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；Model680 型酶標(biāo)儀 美國BioRAD 產(chǎn)品；JY92-IIN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；HT-7800 透射電子顯微鏡 天美中國科學(xué)儀器有限公司；SP-2500 紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；TGL-16G 型臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；IQ5 Realtime PCR儀 美國Bio-RAD。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TG-DHA 脂質(zhì)體的制備 稱取10/70 TG-DHA金槍魚油和98%大豆磷脂酰膽堿，用95%食用酒精溶解。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、減壓濃縮（40 ℃，100 r/min）除去有機(jī)試劑，室溫靜止冷卻30 min，冷卻后加超純水洗膜，然后過200 nm 聚碳酸酯膜，即可得到TG-DHA魚油脂質(zhì)體渾濁液[19]。

1.2.2 TG-DHA 脂質(zhì)體包封率的測定

1.2.2.1 吸收波長的確定 分別將10/70 TG-DHA金槍魚油-石油醚和98%大豆磷脂酰膽堿-石油醚配制成0.6 mg/mL 的溶液。以石油醚為空白對照，分別用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm 波長范圍內(nèi)掃描兩種溶液，以確定最佳波長。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 配制0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的6 種不同濃度的魚油石油醚溶液，以石油醚為空白對照，在1.2.2.1 測得的最佳波長處測定魚油石油醚溶液的吸光度，以魚油石油醚濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.3 包封率測定 取適量TG-DHA 脂質(zhì)體樣品，離心（8000 r/min）20 min。加入正己烷除去游離魚油。從下層溶液中取魚油脂質(zhì)體樣品，用10%TritonX-100 甲醇溶液為破乳劑，超聲破壁（100 W）30 min，加石油醚提取，4000 r/min 離心6 min。取上清液用石油醚定容，在1.2.2.1 測得的最佳波長處測其吸光度，TG-DHA 魚油脂質(zhì)體的吸光度為A，空白脂質(zhì)體的吸光度為A0，計(jì)算△A=A?A0，根據(jù)1.2.2.2得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算包封率[20]。

包封率（EE）：指包埋在脂質(zhì)體里魚油質(zhì)量占添加魚油質(zhì)量的百分比

式中：Win 為包封的魚油質(zhì)量，g；Wtot 為添加的魚油質(zhì)量，g。

1.2.3 TG-DHA 脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)檢測 運(yùn)用負(fù)染色法對脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行透射電子顯微鏡（TEM）觀察。取魚油脂質(zhì)體樣品稀釋至10 mg/mL，將樣品滴在碳支持膜銅網(wǎng)上，然后用濾紙吸去多余液體；再將2%磷鎢酸滴在碳支持膜銅網(wǎng)上，濾紙吸干多余液體，室溫干燥。在放大倍率60000×，工作電壓75 kV的透射電鏡下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)[21]。

1.2.4 動(dòng)物飼養(yǎng)與取樣 30 只SPF 級(jí)的雄性C57BL/6J小鼠暫養(yǎng)一周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為三組，對照組（C），模型組（M），TG-DHA 脂質(zhì)體組（L-DHA），除C 組喂養(yǎng)10%低脂飼料，其他兩組均喂養(yǎng)45%高脂飼料。4 周后開始灌胃，L-DHA 組灌胃TG-DHA 脂質(zhì)體，C 組和M 組灌胃生理鹽水，灌胃劑量1000 mg/kg.bw。實(shí)驗(yàn)小鼠養(yǎng)在普通環(huán)境下，單籠單只，室溫23±2 ℃，濕度55%～58%，12 h/12 h 光暗循環(huán)，飼養(yǎng)期間所有動(dòng)物均自由攝食和飲水。12 周后，摘眼球取血脫頸椎處死小鼠，取小腸，下丘腦等組織，?80 ℃保存。

1.2.5 小鼠體重增長率及能量攝入量的測定

能量攝入量(kcal)=平均攝食量×能量系數(shù)

式中，10%低脂飼料能量系數(shù)：3.58；45%高脂飼料能量系數(shù)：4.73。

1.2.6 血清食欲激素的測定 取上述各組小鼠血清，試劑盒法檢測血清中瘦素、胰島素、POMC 的濃度，具體方法按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.7 RNA 提取與qRT-PCR 使用提取試劑Trizol提取小腸、下丘腦中的總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。使用RNA 純化試劑盒去除蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽離子和有機(jī)雜質(zhì)等。使用5X All-In-One RT裂解反轉(zhuǎn)錄一體試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)成cDNA。使用表2 所示引物，以β-actin 為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照 EvaGreen Express 2X qPCR MasterMix試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)置。使用IQ5 型熒光定量PCR 儀進(jìn)行測定mRNA 的相對表達(dá)量，擴(kuò)增條件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，20 s，95 ℃，15 s（45個(gè)循環(huán)）；5 ℃升溫至95 ℃（0.5 ℃/10 s），mRNA 相對表達(dá)量用2-ΔΔCT 法計(jì)算[22]。引物由上海生工生物工程有限公司合成；引物序列見表2：

表2 引物設(shè)計(jì)序列表Table 2 Primer sequences used for PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±SD 表示，組間差異采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 TG-DHA 脂質(zhì)體包封率的測定

由圖1 可見，魚油-石油醚溶液在274 nm 處有最大吸光度，且在此波長處大豆磷脂酰膽堿-石油醚溶液無吸收波長，因此可以以274 nm 作為TGDHA 脂質(zhì)體的最佳吸收波長。在274 nm 處測得標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=0.9219X+0.0125，R2=0.9922；在此條件下測得TG-DHA 脂質(zhì)體的包封率為85.83%，其包埋效果良好。

圖1 紫外掃描曲線圖Fig.1 Ultraviplet scanning spectrum

2.2 TG-DHA 脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)測定

由圖2 可見，TG-DHA 脂質(zhì)體的形狀為圓形或橢圓形。外觀平滑完整，顆粒飽滿，分布均勻，脂質(zhì)體邊緣幾乎沒有油脂，說明包埋效果良好。

圖2 TG-DHA 脂質(zhì)體形態(tài)圖Fig.2 Morphology of TG-DHA liposome

2.3 TG-DHA 脂質(zhì)體對高脂飲食小鼠能量攝入量的影響

體重增長率常作為高脂飲食誘導(dǎo)肥胖程度的常用指標(biāo)，能量攝入量通常作為食欲變化的常用指標(biāo)。如圖3A 所示，在第72～80 d,L-DHA 組實(shí)驗(yàn)小鼠體重顯著低于M 組實(shí)驗(yàn)小鼠體重。在飼養(yǎng)第44 d 之后，M 組小鼠能量攝入量一直高于C 組和L-DHA組小鼠（由圖3B 可見）。統(tǒng)計(jì)了實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)過程中各組小鼠的體重增長率和能量攝入量，發(fā)現(xiàn)與C 組小鼠相比，M 組小鼠體重增長率（P<0.0001）和平均能量攝入量（P<0.01）極顯著升高。而與M 組小鼠相比，TG-DHA 脂質(zhì)體的攝入極顯著降低了高脂飲食小鼠體重增長率（P<0.001）和能量攝入量（P<0.01）。表明TG-DHA 脂質(zhì)體可能會(huì)通過調(diào)控高脂飲食小鼠的食欲從而降低高脂飲食小鼠的體重。

圖3 TG-DHA 脂質(zhì)體對高脂飲食小鼠體重和能量攝入量的影響（n=10）Fig.3 Effects of TG-DHA liposomes on body weight and energy intake in high fat diet-fed mice（n=10）

2.4 TG-DHA 脂質(zhì)體對高脂飲食小鼠血清食欲激素的影響

瘦素、胰島素、POMC 都是參與調(diào)控食欲的激素。瘦素主要通過作用于下丘腦的代謝調(diào)節(jié)中樞，發(fā)揮抑制食欲的作用；胰島素是一種促進(jìn)食欲的激素；POMC 神經(jīng)元通過釋放阿黑皮素原的剪切產(chǎn)物促黑激素（α-MSH）起到抑制食欲的作用。由圖4A 和圖4C 可見，高脂飲食極顯著降低了實(shí)驗(yàn)小鼠血清中的瘦素（P<0.01），POMC（P<0.001）水平。且M 組小鼠出現(xiàn)了能量攝入量明顯增加的現(xiàn)象（P<0.01）。而TG-DHA 脂質(zhì)體的攝入極顯著升高了實(shí)驗(yàn)小鼠血清瘦素（上調(diào)了23.03%）、POMC（上調(diào)了1.30 倍）水平（P<0.0001），說明TG-DHA 脂質(zhì)體或許可以通過增加高脂飲食小鼠體內(nèi)的瘦素和POMC 的含量從而抑制其食欲[23]。有文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充DHA 會(huì)增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)POMC 水平的增加且會(huì)降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攝食量[24]。如圖4B 所示，與C 組相比，高脂飲食極極顯著升高了實(shí)驗(yàn)小鼠血清中胰島素水平（P<0.01），這可能是由于長期高脂飲食導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)了胰島素抵抗現(xiàn)象，而TG-DHA 脂質(zhì)體的攝入，極顯著降低了高脂飲食小鼠血清胰島素水平（P<0.01）降低了約38.18%。這與Martin 等[25]的研究結(jié)果相一致。

圖4 TG-DHA 脂質(zhì)體對高脂飲食小鼠血清食欲激素水平的影響（n=10）Fig.4 Effect of TG-DHA liposome on serum appetite hormone in high fat diet-fed mice (n=10)

2.5 TG-DHA 脂質(zhì)體對高脂飲食小鼠下丘腦食欲調(diào)節(jié)神經(jīng)肽的影響

研究表明，血清食欲調(diào)節(jié)相關(guān)激素是通過作用于下丘腦，調(diào)節(jié)下丘腦促進(jìn)食欲神經(jīng)肽和抑制食欲神經(jīng)肽的表達(dá)來調(diào)控食欲[26]。NPY 是促進(jìn)食欲的神經(jīng)肽，研究表明向下丘腦注射NPY，會(huì)顯著增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的攝食量[27]。由圖5A 可以看出，高脂飲食具有增加小鼠下丘腦NPY 表達(dá)的趨勢，而TG-DHA 脂質(zhì)體的攝入可以降低這一趨勢，但并未達(dá)到顯著水平（P>0.05）。α-MSH 是一種抑制食欲的神經(jīng)肽，由圖5B 可見，與C 組相比，高脂飲食降低了M 組實(shí)驗(yàn)小鼠下丘腦中α-MSH 的mRNA 相對表達(dá)量（P>0.05），而TG-DHA 脂質(zhì)體的攝入極顯著增加了高脂飲食小鼠下丘腦α-MSH 的相對mRNA 表達(dá)量（P<0.001），增加約1.60 倍。POMC 是合成α-MSH的前體物質(zhì)[28]。這與血清中POMC 檢測結(jié)果一致。

圖5 TG-DHA 脂質(zhì)體對高脂飲食小鼠下丘腦食欲調(diào)節(jié)神經(jīng)肽的影響（n=10）Fig.5 Effect of TG-DHA liposome on Hypothalamic appetite regulating neuropeptides in high fat diet-fed mice(n=10)

2.6 TG-DHA 脂質(zhì)體對高脂飲食小鼠腸道中腦-腸肽表達(dá)的影響

由于TG-DHA 脂質(zhì)體消化吸收的部位主要在胃腸道[29]。DHA 通過小腸上皮細(xì)胞時(shí)很可能會(huì)對相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。因此我們檢測了實(shí)驗(yàn)小鼠小腸中腦-腸肽的表達(dá)，如圖6 所示。CCK、PYY、GLP-1 都是抑制食欲的腦-腸肽。由圖6 所示，高脂飲食具有降低高脂飲食小鼠小腸中腦-腸肽表達(dá)的趨勢（P>0.05），而TG-DHA 魚油脂質(zhì)體的攝入顯著增加了實(shí)驗(yàn)小鼠小腸中PYY（1.32 倍）、GLP-1（78.10%）的mRNA 相對表達(dá)量（P<0.05）。表明TG-DHA 脂質(zhì)體改善高脂飲食小鼠食欲可能與調(diào)節(jié)腸道中腦-腸肽PYY、GLP-1 的mRNA 表達(dá)量有關(guān)。

圖6 TG-DHA 脂質(zhì)體對高脂飲食小鼠腸道中腦-腸肽表達(dá)的影響（n=10）Fig.6 Effect of TG-DHA liposome on the expression levels of brain-gut peptides of gut in high fat diet-fed mice (n=10)

3 討論與結(jié)論

本研究顯示，TG-DHA 脂質(zhì)體的包埋效果良好，其包封率高達(dá)85.83%。透射電子顯微鏡觀察，脂質(zhì)體外觀平滑完整，邊緣幾乎沒有油脂，且顆粒飽滿，大小相對均一。且本課題組之前的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體包埋后降低了己醛，2，4-庚二烯醛等會(huì)產(chǎn)生魚油腥味的物質(zhì)，且TG-DHA 脂質(zhì)體具有良好的穩(wěn)定性[30]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，TG-DHA 脂質(zhì)體可以顯著降低高脂飲食小鼠的體重和能量攝入量。瘦素、胰島素、POMC 都是食欲相關(guān)激素。很多文獻(xiàn)都曾報(bào)道，瘦素可以通過下丘腦中特定的瘦素受體使POMC能神經(jīng)元激活，從而調(diào)節(jié)食欲和能量平衡[31]。與瘦素相似，胰島素也可以通過與下丘腦受體結(jié)合激活POMC 能神經(jīng)元，從而抑制攝食，調(diào)控能量平衡[32]。血清食欲相關(guān)激素的研究結(jié)果顯示，高脂飲食顯著增加了實(shí)驗(yàn)小鼠血清中胰島素水平，這可能是由于長期高脂飲食導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)了胰島素抵抗[33]。而TGDHA 脂質(zhì)體的攝入，顯著降低了高脂飲食小鼠血清胰島素水平。同時(shí)高脂飲食顯著降低了血清中瘦素、POMC 水平，并未出現(xiàn)瘦素抵抗現(xiàn)象，這與王曉芳等[34]的研究結(jié)果相似。而TG-DHA 脂質(zhì)體的攝入顯著增加了高脂飲食小鼠血清中瘦素和POMC 水平水平。

下丘腦在攝食調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[35]。食欲相關(guān)激素通過作用于下丘腦，促進(jìn)促食欲神經(jīng)肽與抑制食欲的神經(jīng)元的表達(dá)來調(diào)節(jié)食欲[26]。NPY 是促進(jìn)食欲的神經(jīng)肽，α-MSH 是抑制食欲的神經(jīng)肽，由POMC 神經(jīng)元裂解產(chǎn)生的。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，高脂飲食具有升高NPY，降低α-MSH mRNA 表達(dá)的趨勢，而TG-DHA 脂質(zhì)體的攝入顯著升高了α-MSH 的mRNA 表達(dá)，這與Schwinkendorf 等[36]的研究結(jié)果相一致。動(dòng)物攝食后，營養(yǎng)物質(zhì)接觸胃腸道從而刺激腦-腸肽的釋放。有文獻(xiàn)報(bào)道，高脂飲食對腸道中腦-腸肽的分泌有所損傷[37]。CCK、PYY、GLP-1 都是抑制食欲的腦-腸肽。Batterham 等發(fā)現(xiàn)小鼠攝食高脂肪飲食后PYY 降低[38]。本研究結(jié)果表明高脂飲食降低了小鼠小腸中CCK、PYY、GLP-1 的mRNA 表達(dá)，TG-DHA 脂質(zhì)體的攝入顯著增加了實(shí)驗(yàn)小鼠小腸PYY，GLP-1 的mRNA 表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究表明TG-DHA 脂質(zhì)體或許可以通過控制食欲相關(guān)激素或胃腸道中的腦-腸肽作用于下丘腦，促進(jìn)抑食欲神經(jīng)肽的表達(dá)，從而起到抑制食欲的作用。本研究可以更加有針對性的開發(fā)魚油新型食品，達(dá)到既經(jīng)濟(jì)安全又高效的調(diào)節(jié)食欲的目的，以食療防治食欲異常，通過調(diào)控食欲縮小超重或肥胖人群的規(guī)模。