南極磷蝦油提取方法及生理活性研究進展

周 莉，張明浩，姚家旭，楊 富

（中南民族大學藥學院，湖北武漢 430074）

南極磷蝦（Euphausia superba）是一種主要以浮游動植物為食，生活在南極海域的群居生物，資源充足，在南極海域的生態系統中起著重要作用[1]。以新鮮南極磷蝦或干燥磷蝦粉為原料，利用合適的提取方法可得到南極磷蝦油[2]。作為一種新型的海洋功能性油脂，南極磷蝦油含有豐富的營養成分，包括磷脂（Phospholipid，PL）、多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFA）、蝦青素（Astaxanthin，AST）、維生素A（Vitamin A，VA）、生育酚（Tocopherols，TOC）等[3?4]，PUFA中二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA），已被證明具有多種生理活性[5]。近年來研究表明，南極磷蝦油對人體健康有多種益處，包括抗炎、預防心血管疾病、抗糖尿病、促進大腦功能和抗癌作用[2]。充足的資源與其具有的多樣功能特性使得南極磷蝦油極具研究價值與開發前景。本文論述了近年來南極磷蝦油的提取方法和生物活性的研究進展，并進行總結與展望，以期為南極磷蝦油的開發應用提供參考。

1 南極磷蝦油的提取

南極磷蝦或者經過初步加工的干制磷蝦粉均可用于磷蝦油的提取，磷蝦捕撈死亡后快速自溶，氟含量升高不利于后續處理[6]，以冷凍磷蝦或干燥磷蝦粉為原料更適合于南極磷蝦油提取。目前南極磷蝦油的提取方法主要有溶劑法、臨界流體法和酶法，與之對應，圖1 選取3 篇相關文獻并展示了其中南極磷蝦油活性物質的含量[3,7?8]。在溶劑法中，使用極性溶劑乙醇提取磷蝦油具有較高的PL（39.20%）和EPA+DHA（28.66 g/100 g）含量，但AST 含量（149.85 mg/kg）和TOC（28.66 mg/100 g）含量較低，丙酮與之相反[3]；在臨界法中，超臨界CO2與亞臨界正丁烷提取磷蝦油均具有較多AST（262.2、248.4 mg/kg）和EPA+DHA（29.81、29.85 g/100 g），而PL 含量差異顯著（18.1%、28.7%）（P<0.05）[7]；最后，堿性蛋白酶對比復合蛋白酶提取磷蝦油具有更高的PL（50.19%）、EPA+DHA（36.91 g/100 g）、AST（520.75 mg/kg）、TOC（39.28 mg/100 g）含量[8]。由此可見，不同提取方式與條件對南極磷蝦油品質存在著較大影響。上述數據來源于不同文獻，不能直接比較三種提取方法優劣，下文對三種磷蝦油提取方法進行簡要介紹。

圖1 不同提取方法對磷蝦油組成的影響Fig.1 Effects of different extraction methods on the composition of krill oil

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法是提取油脂的經典方法，也是文獻報道中提取南極磷蝦油最常用的方法。南極磷蝦油中具有極性PL，中性甘油三酯和疏水性AST 與TOC[3]，提取溶劑的選擇會顯著影響南極磷蝦油的產品質量。

在單一溶劑提取條件下，極性溶劑，如乙醇和異丙醇的提取物具有較高的脂質產量和磷脂含量，但甾醇、蝦青素和維生素含量較低；丙酮提取的脂質產量和磷脂含量最低，但微量元素含量較高[3]。乙醇因具有適當的極性與綠色低毒特性被廣泛應用于磷蝦油提取。張曉慧等[9]使用不同比例的乙醇-水混合溶劑實現了南極磷蝦油的提取（95%乙醇）、精煉（無水乙醇）和富集（30%乙醇），最終得到磷蝦油中PL 含量為706.1 mg/g，EPA 和DHA 含量分別為23.9%，14.2%。這種一體化生產工藝在磷蝦油工業化生產上具有重大價值。

依次以丙酮、正己烷、乙醇為提取溶劑，每次提取15 min，經三步提取后從磷蝦粉中提取得到三種磷蝦油。丙酮提取油中，AST、TOC、VA、膽固醇等次要成分較集中；而乙醇提取油的PL 和PUFA 含量最高，但微量組分少；正己烷提取油則介于二者之間[4]。多步提取不僅使磷蝦油營養價值最大化，也可為后續蝦油特定組分收集提供基礎。而利用混合溶劑進行提取既可以獲得更多的活性物質，同時避免了多步繁瑣操作。Tian 等[10]采用乙酸乙酯-正丁醇混合溶劑（1:1，V/V）進行磷蝦油提取，僅提取5 min 后得到的磷蝦油中PL 含量為27.7%～42.3%，總產油率為4.15%～6.18%。采用乙醇、正己烷或其混合溶劑（1:2，V/V）提取磷蝦油得率分別為21.32%、8.50%和18.75%，PL 含量分別為64.82%、30.20%、55.41%，該混合溶劑同樣可作為合適的提取溶劑，提取油中PUFA 含量高[11]。在另一項乙醇-正己烷混合溶劑提取磷蝦油研究中，若溶劑組成中乙醇>正己烷，提取液不分層，此時降低溶劑中乙醇比例能夠增加油脂產率，在乙醇:正己烷=3:2 時提取率達最高74.49%；若正己烷>乙醇，則提取液在靜置30 min 后發生分層現象，在乙醇:正己烷=2:3 時，總油脂提取率可達95.23%（乙醇層54.77%，己烷層40.46%）[12]。

上述溶劑提取磷蝦油研究中，往往需要使用大量溶劑，料液比達1:6～1:30（W:V），同時耗費較長時間。通過尋找新的提取溶劑或者改進提取方法可以改善這一現象，例如采用親水性可調溶劑N-二甲基環己胺提取南極磷蝦油，該方法溶劑用量少，對環境友好且提取效率與氯仿/甲醇提取相當[13]。另外較為新穎的離子液體或生物溶劑等同樣可應用于油脂的提取，然而其在磷蝦油提取領域鮮有報道[14]。從改進提取方法角度來看，在乙醇提取蝦油前使用1.0%檸檬酸鈉溶液浸泡處理干粉，可提高蝦油中的磷脂含量與流動性，并且降低其酸值。因為檸檬酸鈉能與蝦油中的蛋白質結合，去除磷蝦油中的蛋白質、游離脂肪酸等雜質[15]。在溶劑提取油脂時引入輔助條件，如超聲輔助溶劑提取可以提高出油率并減少提取時間[16]，這是值得嘗試的一種南極磷蝦油提取方法。

1.2 超臨界和亞臨界流體法

超臨界流體法（supercritical fluid extraction，SFE）是利用超臨界流體從原料中提取出特定組分的一種方法，在超臨界狀態下，超臨界流體同時具有氣、液的擴散、溶解能力，從而提供更優的提取效率，在食品、化工等行業漸受歡迎[17?18]。在高價值脂類產品生產中，使用CO2或以丙烷和二甲醚為替代超臨界流體是當前的發展趨勢[19]。

CO2超臨界溫度在31.1 ℃和7.38 MPa，可提取非極性、低分子量的弱極性化合物，其綠色安全特性使之成為油脂提取的主要溶劑[19]。趙泓博[20]將CO2-SFE 與溶劑法相結合，在CO2-SFE 提取過程中，無論夾帶劑乙醇的存在與否，所得油脂絕大部分為甘油三酯。而延長提取時間可提高磷脂含量，經CO2臨界提取150 min 后的蝦油磷脂含量可超過97%，同時增加后續乙醇提取磷蝦粉產物中的EPA 和DHA 含量。除此之外，其創新性地探究了向CO2-SFE 中添加大豆油作載體助溶劑對南極磷蝦油提取的影響，結果發現，大豆油載體助溶劑不僅能提高磷蝦油產率與EPA 和DHA 含量，還能夠改變其產品特性，比如增加其氧化穩定性與流動性，減弱不良風味。劉志東等[21]比較了CO2-SFE、溶劑法與壓榨法對南極磷蝦油的提取效果，結果表明CO2-SFE 的油脂產率接近壓榨法，低于溶劑法（無水乙醇），但CO2-SFE 產物的酸值與碘值均較高。

亞臨界流體法（subcritical fluid extraction，SubFE）利用亞臨界流體為萃取劑，根據極性相似原理提取特定組分，亞臨界狀態是指相對于近臨界和超臨界狀態存在的一種形式，萃取條件相對溫和[22]。具有較低的臨界壓力、溫度及適當親脂性，丙烷和丁烷是廣泛應用于油料提取的兩種流體[23?24]。比較n-butane-SubFE、CO2-SFE 和有機溶劑法提取南極磷蝦油，結果表明，n-butane-SubFE 提取磷蝦油具有超過CO2-SFE 的脂質回收率（81.2%）、PL 含量（28.7 g/100 g）和TOC含量（67.7 mg/kg），以及超過乙醇提取的AST 含量（248.4 mg/kg），且其脂質氧化程度低[7]。隨后Liu等[25]發現，選擇二甲醚為SubFE 流體，得到的磷蝦油相對于n-butane-SubFE 而言，具有更高的脂質回收率（93.77%）、PUFA 含量（33.49%）和AST 含量（218.06 mg/kg）。利用臨界流體法提取南極磷蝦油，除流體種類外，溫度、壓力、流速等參數條件都需要大量實驗進行探究。孫德偉等[26]采用單因素實驗對n-butane-SubFE 提取南極磷蝦油條件進行了優化，在最佳條件下（提取時間120 min，壓力1.0 MPa，溫度40 ℃）脂質提取率為21.39%，磷脂含量為28.68%，其中71.20%為磷脂酰膽堿。

1.3 酶解法

在植物油脂提取過程中，使用蛋白酶、纖維素酶、果膠酶或其他酶混合降解細胞壁可提高油脂收率[27]，其中，蛋白酶可使脂質與蛋白質分離，以此促進使磷蝦油的釋放[28]。在提取南極磷蝦油前加入中性蛋白酶和堿性蛋白酶進行酶解，與空白組相比，酶解磷蝦粉的油脂提取率顯著上升，其中堿性蛋白酶組提取率高于中性蛋白酶組，但中性蛋白酶組具有更高的AST、EPA 和DHA 含量[29]。對常用六種蛋白酶（木瓜蛋白酶、復合蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胰酶、堿性蛋白酶）酶解提取南極磷蝦油比較研究發現，堿性蛋白酶和復合蛋白酶提取磷蝦油的油脂收率較高（5.29%和4.90%），以堿性蛋白酶輔助提磷蝦油中PL（50.19%）和微量元素含量，其效果均高于另外五種蛋白酶[8]。將堿性蛋白酶與復合蛋白酶一同加入以提取磷蝦油，提取效果同樣優于溶劑提取[28]。Zhou 等[30]研究了不同種類酶的提取效果，包括中性蛋白酶、胰蛋白酶、復合蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶，結論與前文一致，復合蛋白酶的脂質回收率最高。經響應曲面優化提取條件后（酶濃度0.16%，45 ℃下酶解2.9 h），磷蝦油提取率可達86.02%。

南極磷蝦內源酶活性極強，在捕撈死亡后容易發生自溶，故可以利用南極磷蝦自溶酶結合外源酶對其進行酶解[31]。外源木瓜蛋白酶與內源酶能夠產生協同作用，在中性條件下酶解2 h 所得南極磷蝦油中EPA+DHA 質量分數大于兩者單獨作用[32]。合理利用內源酶可以減少外源酶使用量，甚至不需要使用外源酶。以大豆油為溶劑，從自溶6 h 的南極磷蝦水解物中富集營養成分，回收油中含有44.24 mg/kg的AST，總脂肪酸中含有1.1% EPA 和0.6% DHA[33]，這與上文中大豆油做載體助溶劑提取磷蝦油的研究相似，均體現了綠色提取理念。雖然利用蛋白酶解能提高脂質成分的產率，但是上述文獻中酶解所需時間較長（2～6 h），該方法仍需要進一步改良。

2 南極磷蝦油的生理活性

南極磷蝦油含有豐富的營養成分，如EPA、DHA、PL、TOC、VA、AST 等，其中DHA 和EPA 能夠促進大腦發育，改善腦功能，調節脂質和糖代謝。有研究證實，磷脂形式存在的DHA/EPA 在發揮其功能特性方面優于甘油三酯或乙酯形式[5]，而高磷脂含量正是南磷蝦油組成特征之一[2]。蝦青素屬于類胡蘿卜素類，有顯著的抗氧化能力，研究發現蝦青素具有抗炎、抗氧化、促凋亡、抗癌等多種生物活性[34]。多種營養成分共同存在于南極磷蝦油中，使之具有較大的健康益處。關于磷蝦油的功能特性目前已經進行了大量的研究，從細胞、動物以及臨床試驗中發現，南極磷蝦油具有抗炎、抗氧化、預防心血管疾病、抗糖尿病、促進大腦功能和抗癌等作用[2]，表1 列出了部分關于磷蝦油生理活性的研究進展，包括其功能作用、磷蝦油組成與實驗方法及結論。文獻中使用的南極磷蝦油不盡相同，部分來源于商品磷蝦油，部分來源于實驗室提取，導致其品質和發揮功效的生理活性物質種類和含量存在差異，這種差異在南極磷蝦油功能活性研究中是需要考慮的。

表1 部分磷蝦油生理活性的研究Table 1 Partial study on physiological activity of krill oil

2.1 心血管保護作用

血漿中的甘三酯（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（Highdensity liptein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cho lesterol，LDL-C）等水平異常是引發心血管疾病的重要潛在性危險因素[52]。在高脂肪食物中添加磷蝦油能夠降低LDLC，顯著改善C57BL/6J 小鼠的血脂異常、脂肪肝和葡萄糖代謝，此外還能降低肝臟的氧化損傷[35]。與之類似，正常飲食大鼠服用南極磷蝦油與魚油后，磷蝦油相比魚油有著更強的降低血清TG 和TC 能力[36]。磷蝦油與魚油均有降低血脂和調節脂質穩態的作用，但作用機制不同，作用效果也不同。魚油降低極低密度脂蛋白（Very low density lipoprotein，VLDL），磷蝦油降低血漿非酯化脂肪酸[37]。磷蝦油還能引起腸道菌群結構發生劑量依賴性改變，此變化與高脂血癥的減輕有關[38]。在志愿者飲食中添加南極磷蝦油同樣產生了降總膽固醇作用，能夠有效降低心血管疾病風險[39]。磷蝦油除降低TG、TC 水平及高血壓大鼠的血壓外[40]，Parolini 等[41]還證明了南極磷蝦油和磷蝦蛋白對載脂蛋白E 缺乏小鼠動脈粥樣硬化的發展有延緩作用。

2.2 抗炎作用

炎癥是機體對有害物質產生的一種反應，被認為是機體的有益過程，但同樣會引起機體不適，例如發熱和疼痛，此外，慢性炎癥與類風濕關節炎、哮喘、炎癥性腸病、牛皮癬等疾病密切相關[2]，為了減輕疼痛和減少慢性炎癥的發生，在自然界中尋找具有優異鎮痛抗炎活性物質一直是醫藥學科的研究熱點[53]。南極磷蝦油能夠對TFN-α和TFN-γ誘導產生炎癥的CACO-2、HT29 細胞進行處理，結果使促炎細胞因子mRNA 表達減少，上皮完整性增加，從而減輕腸道炎癥的發生[42]。經臭氧處理后磷蝦油能減少脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW 264.7 細胞IL-1β、IL-6、TNF-α的表達[43]。向患有輕度膝關節疼痛受試者的飲食中補充南極磷蝦油，膝關節炎量表和血尿生化參數顯示南極磷蝦油具有抑制促炎性介質和減緩骨關節炎發展的作用[44]。

2.3 神經保護作用

大多數神經退行性疾病，如阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）和帕金森氏病（Parkinson’s disease，PD）起因復雜，但往往與神經炎癥相關，因此，對氧化途徑和炎癥反應的抑制是治療神經退行性疾病的一個研究方向[54]。南極磷蝦油可能通過抑制細胞凋亡反應和氧化損傷預防甲基苯丙胺誘導的神經毒性[45]。磷蝦油對LPS 誘導AD 小鼠模型神經炎癥的影響研究表明，飲食中添加磷蝦油抑制了誘導型一氧化氮合酶和環氧合酶-2 的表達，降低了活性氧和丙二醛的水平，能夠減輕氧化應激和神經炎癥引起的腦損傷，降低淀粉樣變性的產生和改善記憶功能[46]。而在半乳糖誘導腦衰老小鼠實驗中，磷蝦油減少了多巴胺和cAMP 調節蛋白以及參與鈣通道蛋白的表達，緩解腸道菌群的失調，對腦衰老產生有益作用[47]。通過生化參數測定及水迷宮實驗等方法評價磷蝦油喂食對小鼠認知功能的影響，結果表明，磷蝦油可通過減少海馬Aβ42水平和降低氧化損傷，改善認知功能及減輕焦慮，南極磷蝦油可作為具有神經保功效的食品補充劑和或功能性成分[48]。

2.4 改善骨質疏松作用

骨質疏松癥可導致骨脆性增加，骨折幾率增高，是最常見的骨骼疾病，多見于絕經后女性和老年男性，且女性的患病率高于男性。隨著老齡化程度增加，骨質疏松癥已成為各國所面臨的健康問題[55]。對糖皮質激素性骨質疏松小鼠補充南極磷蝦油90 d后，通過小鼠的骨密度、生物力學強度和松質骨微觀結構，證明了南極磷蝦油可顯著防止骨丟失，改善糖皮質激素誘導的骨質疏松癥，促進骨的形成[49]。與之相似，分別給予ICR 小鼠大豆油與磷蝦油作飲食補充劑，發現磷蝦油通過GH/IGF-1 通路促進了骨的縱向生長，并增加了骨骼肌礦物質含量和強度[50]。對軟骨退變小鼠補充磷蝦油8 周后改善了其軟骨結構，抑制了軟骨細胞的增生性分化與關節軟骨的異常凋亡[51]。此外，南極磷蝦磷酸化肽對去卵巢大鼠同樣具有改善松質骨結構和生化特性的功效[56]。

3 總結與展望

南極磷蝦油作為一種新型的海洋功能性油脂，含有豐富的營養成分，對人體健康有多種益處，具有廣闊的應用前景。傳統溶劑法提取磷蝦油是目前最常用的一種提取方式，技術成熟，成本低、步驟少，未來新型綠色溶劑的開發與提取工藝優化可解決溶劑用量大，回收處理困難以及提取時間長等不足。酶解法提取磷蝦油條件溫和，綠色環保且油脂產率高，外源酶與內源酶的協同作用使酶解法更適于鮮蝦的提取，外源酶的種類是提取過程中最重要的影響因素，另外，酶解耗時長也是需要考慮的問題。臨界流體法雖然對設備要求高，但能夠通過控制提取條件改變臨界流體的選擇，極具靈活性，因此需要在諸多試驗基礎上優化提取參數，使之適于磷蝦油的提取。未來南極磷蝦油提取技術的突破創新將會對磷蝦油應用研究產生很大推動作用。

南極磷蝦油產生各種功能活性作用的機制復雜，雖有一定報道，但并不全面，其如今研究較多的是對血脂的調節作用。此外，許多學者在研究中僅關注南極磷蝦油中EPA 和DHA 成分含量，但在這之外還存在多種活性物質，這些物質之間是否存在相互作用，又或者各自發揮不同的生理活性作用仍不清楚，南極磷蝦油組成與其功效之間的關系如何，這些問題亟待未來研究探尋。