β-伴大豆球蛋白糖基化產物的致敏性研究

陳曉旭，吳玥琨，張燕*

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.南開大學醫學院，天津市食品科學與健康重點實驗室，天津 300071）

近年來，人們對于食物過敏的關注度越來越高。常見的食物過敏原包括花生、大豆、奶、蛋、魚、貝類、堅果等，食品標識委員會將其定義為八大食物過敏原[1]。其中大豆為人們膳食提供了豐富的植物蛋白，而致敏性是它的主要劣勢，阻礙其在食品加工中的應用。大豆致敏蛋白中β-伴大豆球蛋白約占大豆蛋白總量的30%[2]，是大豆主要的過敏原[3]。β-伴大豆球蛋白是由α、α′和β亞基組成的三聚體結構，每個亞基由酸性肽鏈和堿性肽鏈組成，結構非常穩定，因此β-伴大豆球蛋白的致敏性相對穩定。

目前已經報道了很多用來降低蛋白質的致敏性的食品加工方法[4-6]，包括發酵、煎炸、烘烤等，主要是通過蛋白質分子內、分子間的共價鍵或非共價鍵相互作用，導致二級或三級結構改變，從而影響蛋白質的致敏性。糖基化反應是在酶的作用下，蛋白質的氨基和還原糖的羰基之間形成糖蛋白的過程[7]。在食品加工中糖基化反應可能引起蛋白質功能特性發生改變，并對蛋白質具有一定的修飾作用，可修飾蛋白質的抗原表位，從而影響蛋白質的致敏性[8]。據報道，經糖基化反應后降低了花生過敏原的致敏性[9]。劉俊等將牛血清蛋白和α-乳白蛋白經超聲波輔助糖基化處理后，發現蛋白質的結構與功能性質發生了改變，并降低了α-乳白蛋白的致敏性[10]。糖基化反應中，蛋白質的抗原表位發生了變化，從而影響蛋白質的致敏性[11]。

目前，評價糖基化修飾對過敏原的影響，主要是通過酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和蛋白質免疫印跡法檢測過敏原免疫活性，但這類方法缺乏嚴謹性，還有待進一步完善。因此本研究選擇食品加工中常用的配料葡萄糖和β-伴大豆球蛋白，通過幾種典型的熱加工條件，制備β-伴大豆球蛋白的糖基化修飾產物，并進行體內動物實驗，探討加熱過程中葡萄糖對β-伴大豆球蛋白的糖基化修飾作用，以及對β-伴大豆球蛋白致敏性的影響，為通過食品加工方式降低蛋白致敏性奠定了一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-伴大豆球蛋白：自制；葡萄糖：國藥集團化學試劑有限公司；霍亂毒素（cholera toxin，CT）：美國 Sigma-Aldrich公司；組胺、免疫球蛋白（immunoglobulin E，IgE）、類胰蛋白酶試劑盒：南京建成有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Milli-Q超純水儀：德國默克密理博公司；FE20K型PH計：瑞士梅特勒-托利多公司；5804R離心機：美國Beckman公司；MS3渦旋混合器：德國IKA公司；SB-4200D超聲波清洗機：中國新芝生物科技股份有限公司；BL610電子天平：德國Sartorius公司；UF-110烘箱：上海美墨爾特貿易有限公司；Evolution 300紫外分光光度計：美國Thermo公司；SBH200D/3干浴器：英國Stuart公司。

1.3 方法

1.3.1 β-伴大豆球蛋白的制備

參考文獻[12]中方法對β-伴大豆球蛋白進行分離及提純。

1.3.2 β-伴大豆球蛋白糖基化產物的制備

將50 mg純度為92.46%的β-伴大豆球蛋白加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液，葡萄糖與β-伴大豆球蛋白的質量比為4∶1，反應的條件分別為低溫糖基化：70℃加熱8 h；蒸煮糖基化：100℃加熱30 min；高壓滅菌糖基化：121℃加熱15 min。所有條件下反應后的糖基化產物需透析處理除掉游離糖等小分子。

1.3.3 免疫方法

雌性、4周齡、質量在（20±5）g的BALB/c小鼠，飼養在溫度（25.5±2）℃和濕度70%的條件下。將50只小鼠，隨機分為5組，每組10只。第1周小鼠正常飲食，第2周開始，灌胃小鼠300 μL生理鹽水（空白組，n=10）、灌胃小鼠 300 μL β-伴大豆球蛋白（1 mg/mL）和霍亂毒素（CT）（0.01 mg/mL）混合液（過敏組，n=10）、灌胃小鼠300 μL低溫糖基化產物（1 mg/mL）和CT（0.01 mg/mL）混合液（低溫糖基化組，n=10）、灌胃小鼠300 μL 蒸煮糖基化產物（1 mg/mL）和 CT（0.01 mg/mL）混合液（蒸煮糖基化組，n=10）和灌胃小鼠300 μL高壓滅菌糖基化產物（1 mg/mL）和 CT（0.01 mg/mL）混合液（高壓滅菌糖基化組，n=10），以上灌胃的所有混合液溶劑均為生理鹽水。每周灌胃1次，第5次激發，觀察過敏癥狀后，處死，取血清-80℃保存待測。

1.3.4 過敏癥狀評分

每組小鼠激發后30 min～50 min，仔細觀察小鼠的行為及體貌特征并依照表1中表述的內容進行評價[13]。

表1 小鼠過敏癥狀評分標準Table 1 Scoring standard for allergic mouse symptoms

1.3.5 血清中組胺含量的測定

采用組胺含量測定試劑盒進行測定。

1.3.6 血清中免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）含量的測定

采用IgE含量測定試劑盒試劑盒進行測定。

1.3.7 血清中類胰蛋白酶含量的測定

采用類胰蛋白酶含量測定試劑盒進行測定。

1.3.8 糖基化產物接枝度的測定

參照文獻[14]中的方法測定β-伴大豆球蛋白糖基化產物的接枝度。將2 mg/mL 200 μL β-伴大豆球蛋白糖基化產物溶液（溶劑為pH 7.4的磷酸鹽緩沖液）加入4 mL鄰苯二甲醛試劑，并在35℃下水浴2 min，用紫外分光光度計分別測其在340 nm處的吸光值。空白管里分別加入4 mL鄰苯二甲醛和200 μL磷酸鹽緩沖液。

接枝度（grafting degree，DG）計算公式如下。

式中：At為接枝物溶液的吸光值；A0為單一蛋白溶液在同一反應條件下的吸光值。

1.3.9 糖基化產物內源熒光性的測定

參照文獻[15]中的方法測定糖基化產物內源熒光性。用磷酸鹽緩沖液溶解，配制成濃度為0.2 mg/mL的β-伴大豆球蛋白溶液。熒光儀參數設置激發波長為295 nm，掃描速度為60 nm/min。最終測定β-伴大豆球蛋白的熒光發射光譜范圍在300 nm～400 nm。

1.3.10 糖基化產物二級結構的測定

分別準確的稱取2mg的β-伴大豆球蛋白和150mg的溴化鉀，充分的研磨，再將研磨后的混合粉均勻的放于壓片機中，進行紅外光譜掃描。以溴化鉀作為空白樣，充分研磨后放置壓片機中，再進行紅外光譜掃描。紅外光譜分別進行背景掃描和樣品掃描，參數設置掃描的波段為4 000 cm-1～1 000 cm-1、分辨率為4 cm-1。采用OMNIC 8.0軟件對數據進行處理。

1.4 統計與分析

每組試驗至少3次重復，本試驗所有數據通過軟件SPSS 14.0中單因素ANOVA檢驗和Duncan test進行分析，結果以平均值±標準偏差（mean±SD）表示，p<0.05表示有顯著差異，所用作圖軟件為Origin 9。

2 結果與分析

2.1 過敏癥狀評分

不同糖基化條件對小鼠過敏癥狀的影響，見圖1。

圖1 小鼠過敏癥狀評分Fig.1 Mouse allergy symptom score

如圖1所示，與空白組相比，過敏組的小鼠過敏癥狀評分極顯著升高；與過敏組相比，蒸煮糖基化組過敏癥狀評分顯著降低；與低溫糖基化組相比，高壓滅菌糖基化組過敏癥狀評分差異不顯著。空白組小鼠無異常現象；過敏組小鼠出現了嚴重的口唇腫脹、毛發豎立、運動活力下降等癥狀；低溫糖基化組中有部分小鼠出現運動活力下降、毛發豎立、抓撓面部等癥狀；灌胃蒸煮糖基化產物和高壓滅菌糖基化產物小鼠過敏反應癥狀不明顯，說明過敏反應較弱。

2.2 體重分析

不同糖基化條件對小鼠體重的影響，見圖2。

圖2 小鼠體重的測定Fig.2 Determination of mouse body weight

由圖2可知，與空白組相比，過敏組小鼠體重極顯著降低。與低溫糖基化組和蒸煮糖基化組相比，灌胃高壓滅菌糖基化產物的小鼠體重差異不顯著。可能是因為灌胃不同加工條件下糖基化產物的小鼠發生了不同程度的過敏反應，導致小鼠體重不同程度的降低[16]。結果表明，高壓滅菌糖基化組中的小鼠體重降低程度最小，過敏反應程度最弱。

2.3 組胺含量分析

不同糖基化條件對小鼠血清中組胺含量的影響，見圖3。

圖3 小鼠血清中組胺含量測定Fig.3 Determination of histamine in mouse serum

如圖3所示，小鼠血清中組胺水平過敏組和低溫糖基化組相比，過敏組小鼠組胺含量顯著升高。與低溫糖基化組相比，蒸煮糖基化組和高壓滅菌糖基化組中的小鼠組胺含量差異不顯著。不同條件下的糖基化組中小鼠的組胺含量出現不同程度的降低可能是因為肥大細胞脫顆粒作用降低，因此減少了組胺的釋放[17]。結果表明，高壓滅菌糖基化組中小鼠的組胺含量最低，導致過敏反應程度最弱。

2.4 IgE含量分析

不同糖基化條件對小鼠血清中IgE含量的影響，見圖4。

圖4 小鼠血清中IgE含量測定Fig.4 Determination of IgE in mouse serum

如圖4所示，與空白組相比，過敏組小鼠IgE含量極顯著升高。與低溫糖基化組相比，蒸煮糖基化組和高壓滅菌糖基化組的小鼠IgE含量差異不顯著。IgE含量是衡量過敏反應程度的重要指標[18]。結果表明，灌胃高壓滅菌糖基化產物的小鼠血清中IgE含量最低，導致小鼠的過敏反應程度最弱。

2.5 類胰蛋白酶含量的分析

不同糖基化條件對小鼠血清中類胰蛋白酶含量的影響見圖5。

圖5 小鼠血清中類胰蛋白酶含量測定Fig.5 Determination of tryptase content in mouse serum

如圖5所示，與空白組相比，過敏組小鼠的類胰蛋白酶含量極顯著升高。與過敏組相比，各糖基化組小鼠的血清中類胰蛋白酶含量均有不同程度的降低。與低溫糖基化組相比，灌胃高壓滅菌糖基化產物小鼠的類胰蛋白酶含量差異顯著。因為類胰蛋白酶含量是過敏患者血清中檢測的重要指標，可以一定程度上反應過敏的程度[19]，結果表明高壓滅菌組的小鼠類胰蛋白酶含量最低，過敏反應程度最弱。

2.6 糖基化產物接枝度的分析

不同條件下的糖基化產物對接枝度的影響，見圖6。

圖6 糖基化產物接枝度測定Fig.6 Determination of the degree of grafting of glycosylation products

從圖6中可看出，β-伴大豆球蛋白與葡萄糖在低溫、蒸煮和高壓滅菌條件處理后的接枝度分別為10.46%、15.06%和35.17%。與低溫糖基化組相比，高壓滅菌糖基化組的接枝度極顯著升高。結果表明，隨著加工溫度的升高接枝度也呈顯著升高的趨勢，原因可能是β-伴大豆球蛋白是三聚糖蛋白，反應溫度越高，導致分子結構越容易發生改變[14]。由此表明，高壓滅菌糖基化產物的接枝度最高，從而導致蛋白致敏性最弱。

2.7 糖基化產物內源熒光性的分析

蛋白質的內源熒光性是通過測定生物大分子的熒光發色團，從而獲得生物大分子的結構、功能等信息。蛋白質分子中能發射熒光的氨基酸主要有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸[20]。因此，通過內源熒光光譜測定蛋白質熒光強度，可以判斷蛋白質的結構是否發生改變。不同條件下的糖基化產物對熒光強度的影響，見圖7。

圖7 糖基化產物內源熒光性的測定Fig.7 Determination of endogenous fluorescence of glycosylation products

從圖7可以看出，與低溫糖基化產物比較，蒸煮糖基化和高壓滅菌糖基化產物的熒光強度明顯降低。原因可能有以下幾種：1）熱處理后蛋白質的結構發生了變化，色氨酸殘基埋藏到疏水的環境中[21]；2）葡萄糖側鏈的蛋白質結構對色氨酸殘基具有屏蔽作用[22]；3）色氨酸發生熒光淬滅[23]；4）因為反應溫度太高，蛋白質分子迅速展開聚集，色氨酸殘基大量損失[24]，導致熒光強度下降。結果說明，高壓滅菌糖基化產物熒光強度最低，導致蛋白致敏性最弱。

2.8 糖基化產物二級結構的分析

蛋白質的二級結構是肽鏈中有規則的重復的構象，主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲[25]。不同條件下的糖基化產物對二級結構的影響見表2。

從表2可以發現，與蒸煮糖基化和高壓滅菌糖基化產物相比，低溫糖基化產物α-螺旋含量顯著降低。與低溫糖基化和蒸煮糖基化產物相比，高壓滅菌糖基化產物二級結構中β-折疊和β-轉角的含量顯著降低，無規則卷曲的含量顯著增加。隨著反應溫度的升高，蛋白質中有序結構轉變成無序結構。在糖基化反應中蛋白質與糖之間以共價鍵聚集，其中α-螺旋、β-折疊、β-轉角等通常情況下存在于肽鏈的內部，熱處理后可能會導致二級結構發生改變[26]。結果表明，高壓滅菌糖基化產物二級結構中β-折疊、β-轉角含量最低和無規則卷曲含量最高，導致蛋白致敏性最弱。

表2 糖基化產物二級結構的測定Table 2 Determination of the secondary structure of glycosylation products

3 結論

通過評估典型過敏指標以及糖基化產物結構，發現與低溫糖基化產物和蒸煮糖基化產物相比，高壓滅菌糖基化產物的結構變化最顯著，導致蛋白致敏性最弱。本研究評價了不同加工條件下β-伴大豆球蛋白糖基化產物的致敏性，為有效降低食品熱加工中大豆制品的致敏性提供重要的參考。