高耐受Pb2+酵母菌抗氧化及吸附Pb2+特性的研究

張豐生，李麗杰，賀銀鳳

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

重金屬是指密度大于4.5 g/cm3的金屬，常見的有鉻、銅、鎘、鎳等，鉛（plumbum，Pb）是其中對環境和人體危害較大的一種[1]。在灌溉小麥和水稻時，如果使用含鉛濃度在0.1 mg/L～4.4 mg/L的水，成熟作物中的含鉛量就會顯著增加[2]。有學者分別研究了重金屬鉛對野生植物種子發芽和水稻生長情況的影響，結果表明，Pb的污染對野生種子的發芽和水稻根系的生長影響顯著[3-4]。鉛還能通過呼吸和消化兩大途徑進入機體并蓄積于體內，產生大量的自由基攻擊生物大分子，主要體現在DNA損傷和對特定酶的氧化鈍化，甚至可能破壞細胞的結構和功能，造成機體各大器官等一系列的系統損傷[5-8]。具體表現為：小腦和大腦的皮層細胞損傷[9]；對兒童智力發育產生損害[10]；免疫系統損傷[11]；心血管系統損傷[12]；腎臟系統損傷[13-14]等。重金屬鉛對人體的這種危害已經不容忽視，對重金屬鉛中毒的防治與治療引起眾多學者的關注，除西醫絡合類藥物及食療驅鉛等治療方法外，由于微生物具有種類多、來源廣、易獲取等特點，使得對鉛有吸附性及抗氧化活性微生物的利用提供了極大的可能性。

酵母菌是一種單細胞真核微生物，在人類漫長的歷史長河中，很早被人們發現和利用。直到現在，酵母菌的研究熱度和使用熱度依舊不減，是世界上被研究最多的微生物之一。根據對酵母菌抗氧化性的研究，酵母菌在受到重金屬脅迫時，自身的抗氧化應激酶系統能夠緩解重金屬對菌株的脅迫傷害。重金屬離子在與細胞壁接觸過程中，會與其中多種官能團上的氧、氮、磷、硫等原子配位發生絡合反應[15-16]。李昌寶等通過對11種酵母發酵的冬瓜酒進行抗氧化性能力比較發現，BV818酵母發酵的冬瓜酒具有良好的·OH、O-2·、DPPH·清除能力，其清除率分別為6.70%、43.25%、45.73%[17]。崔靜等對釀酒酵母細胞壁上的多糖類物質抗氧化性進行研究發現，當多糖質量濃度升高至2.0 mg/mL時，對·OH清除率高達91.5%[18]；王欣卉等通過研究酵母菌中的金屬硫蛋白發現，其能夠顯著降低錦鯉腎臟中的Pb2+含量[19]。邵昭等通過對固定化酵母菌吸附重金屬離子規律進行研究發現，在一定溫度范圍內，溫度升高對吸附能力的提高有一定作用[20]。本文選擇對Pb2+的耐受質量濃度在6 000 mg/L～7 000 mg/L之間的異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8，對其進行一系列抗氧化能力試驗，并研究pH值、濕菌體濃度、初始Pb2+濃度、吸附溫度、吸附時間等因素對酵母菌吸附Pb2+的影響，為同時具有抗氧化和吸附重金屬特性產品的開發提供參考。

1 材料與方法

異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8：內蒙古農業大學食品學院食品生物技術團隊提供；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH]：北京Coolaber公司；2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）：山西東亞化學工業有限公司；水楊酸、鄰苯三酚、亞油酸、三羥甲基氨基甲烷 [tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、2，6-二叔丁基對甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、硫酸亞鐵[iron（II）sulfate heptahydrate，FeSO4]、抗壞血酸（ascorbic acid，VC）等均為分析純。

KDC-140HR型高速冷凍離心機：安徽中佳儀器有限公司；MBR-022UP型深孔板高速振搖培養箱：日本TAITEC公司；UV-1100型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；JY 88-IIN型超聲波細胞粉碎機：寧波生物股份有限公司；HF-SAFE 1500型生物安全柜：力康生物醫療有限公司；SX-500型全自動高壓滅菌鍋：日本TOMY公司；AAS990型火焰原子吸收光譜儀：北京普析通用公司。

1.1 樣品的制備

將篩選出的高耐受Pb2+的W.anomalus QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8利用酵母提取物蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）液體培養基進行活化（30℃，160 r/min）培養三代，利用無菌超純水將第三代菌液離心（4 000 r/min，4 min）洗滌3次，制成約為107CFU/mL菌懸液，吸取5 mL，利用超聲波破碎儀（300 W，4 s/6 s，14 min）冰浴破碎處理，離心，取上清液，獲得無細胞提取物。

1.2 菌株抗氧化能力的測定

1.2.1 DPPH自由基清除能力的測定

以 1、50、100、150、200 μg/mL 的 VC濃度為橫坐標，DPPH自由基清除率為縱坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程為：y=0.397 9x+7.033，R2=0.992 2。用2 mL超純水替代樣品為陰性對照組，用1 mL無水乙醇代替DPPH無水乙醇溶液為空白組，1.5 mL超純水與同體積無水乙醇混合溶液調零。清除率按公式（1）計算[21]。根據標準曲線回歸方程計算清除能力。

式中：A0為樣品組的吸光值；A1為空白組的吸光值；A2為對照組的吸光值。

1.2.2 羥基自由基清除能力的測定

以 1、100、200、400、800 μg/mL 的 VC濃度為橫坐標，羥基自由基清除率為縱坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程為：y=0.123 4x+0.805 3，R2=0.992 8。用超純水替代樣品為陰性對照組。清除率按公式（2）計算[22]。根據標準曲線回歸方程計算清除能力。

式中：A1為樣品組的吸光值A0為陰性對照組的吸光值[22]。

1.2.3 超氧陰離子自由基清除能力的測定

以 1、50、100、200、300 μg/mL 的 VC濃度為橫坐標，超氧陰離子自由基清除率為縱坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程為：y=0.3x+10.748，R2=0.992 6。用超純水替代樣品為陰性對照組。清除率按以公式（3）計算[17]。根據標準曲線回歸方程計算清除能力。

式中：A1為樣品組的吸光值；A0為陰性對照組的吸光值。

1.2.4 脂質過氧化物抑制能力的測定

以 1、50、100、150、200 μg/mL 的 VC濃度為橫坐標，脂質過氧化物清除率為縱坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程為：y=0.382 9x+8.717 7，R2=0.990 1。用超純水替代樣品為陰性對照組。清除率按公式（4）計算[23]。根據標準曲線回歸方程計算抑制脂質過氧化能力。

式中：A0為樣品組的吸光值；AX為陰性對照組的吸光值。

1.3 酵母菌對Pb2+吸附特性的研究

以 0、20、40、60、80、100 mg/L 的 Pb2+儲備液為橫坐標，火焰原子吸收分光光度計測定的吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程為：y=0.009x+0.001 8，R2=0.999 7。根據公式（5）、（6）計算 Pb2+吸附量和吸附率。

式中：b為未接種酵母菌處理溶液中的Pb2+含量，mg；c為酵母菌處理后溶液中的 Pb2+含量，mg；d為酵母菌的添加量，g。

1.3.1 pH值對酵母菌吸附Pb2+的影響

將 1.4 mL 不同 pH（2.0～6.0）的 100 mg/L Pb2+儲備液加到48孔深孔板中，再加入菌體濃度為15 g/L的菌懸液，在深孔板搖床（800 r/min，30℃，120 min）條件下進行Pb2+吸附試驗。

1.3.2 菌體濃度對酵母菌吸附Pb2+的影響

將1.4 mL pH 6.0的100 mg/L Pb2+儲備液加到48孔深孔板中，再加入不同菌體濃度（9 g/L～17 g/L）的菌懸液，在深孔板搖床（800 r/min，30℃，120 min）條件下進行Pb2+吸附試驗。

1.3.3 初始Pb2+濃度對酵母菌吸附Pb2+的影響

將1.4mLpH6.0的不同Pb2+濃度（100mg/L～500mg/L）儲備液加到48孔方形深孔板中，再加入菌體濃度為15 g/L的菌懸液，在深孔板搖床（800 r/min，30℃，120 min）條件下進行Pb2+吸附試驗。

1.3.4 吸附溫度對酵母菌吸附Pb2+的影響

將1.4 mL pH 6.0的100 mg/L Pb2+儲備液加到48孔深孔板中，再加入菌體濃度為15 g/L的菌懸液，在不同溫度（25℃～45℃）下利用深孔板搖床（800 r/min，120 min）進行Pb2+吸附試驗。

1.3.5 吸附時間對酵母菌吸附Pb2+的影響

將1.4 mL pH 6.0的100 mg/L Pb2+儲備液加到48孔深孔板中，再加入濃度為15g/L的菌懸液，利用深孔板搖床（30℃，800 r/min）分別吸附不同時間（60 min～180min）進行Pb2+吸附試驗。

1.4 數據處理

每組試驗3次平行3次重復，所有數據均利用SPSS 23.0中的one-way ANOVA和Origin 2018進行數據分析及作圖，測定結果以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 W.anomalus抗氧化能力測定結果

2.1.1 DPPH·清除能力

按1.2.1方法，酵母菌清除DPPH·結果見圖1。

圖1 酵母菌菌懸液和無細胞提取物對DPPH·的清除能力Fig.1 DPPH free radical scavenging ability of yeast suspension and cell-free extract

由圖1可知，不同的酵母菌對DPPH·清除能力不同，W.anomalus QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8 菌懸液對DPPH·清除能力分別是（66.37±2.21）、（85.09±1.11）、（76.89±3.15）μg/mL；超聲破碎離心后的無細胞提取物對 DPPH·清除能力分別是（38.87±1.69）、（46.70±2.25）、（48.45±2.02)μg/mL。菌懸液清除DPPH·水平顯著高于無細胞提取物（p<0.05)，其中W.anomalus QI-1-7菌懸液對DPPH·清除能力最高，但低于陳君試驗中酵母菌對DPPH·的清除能力，原因可能是不同酵母菌間產生的抗氧化活性物質分布不同（細胞內或菌體表面），從而導致不同酵母菌清除DPPH·能力不同[24]。

2.1.2 羥基自由基清除能力

按1.2.2方法，酵母菌清除羥基自由基結果見圖2。

圖2 酵母菌菌懸液和無細胞提取物對羥自由基的清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ability of yeast suspension and cell-free extract

由圖2可知，不同的酵母菌對羥基自由基清除能力不同，W.anomalus QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8 菌懸液清除羥基自由基的能力分別為（117.95±5.01）、（240.88±7.69）、（100.20±2.76）μg/mL 超聲破碎離心后的無細胞提取物對羥基自由基的清除能力分別是（34.88±0.98）、（107.85±4.55）、（43.56±2.54）μg/mL。W.anomalus菌懸液清除羥基自由基的水平顯著高于無細胞提取物（p<0.05），無論菌懸液還是無細胞提取物，W.anomalus QI-1-7清除羥基自由基能力最優。與清除DPPH·不同的是，陳君[24]試驗中酵母菌對羥基自由基的清除能力為 140.81 μg/mL，顯著低于 W.anomalus QI-1-7。

2.1.3 超氧陰離子自由基清除能力

按1.2.3方法，酵母菌清除超氧陰離子自由基結果見圖3。

由圖3可知，酵母菌不同，對超氧陰離子自由基的清除作用也會有所改變，其中W.anomalus QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8菌懸液清除超氧陰離子自由基能力分別是（137.74±7.30）、（171.41±6.92）、（158.60±7.97）μg/mL；超聲破碎離心后其清除能力分別是（24.70±2.15）、（5.74±0.57）、（34.27±0.91）μg/mL，W.anomalus菌懸液清除超氧陰離子自由基的水平顯著高于（p<0.05）無細胞提取物。由于存在種間差異，特性有所不同，菌懸液和無細胞提取物清除超氧陰離子自由基的能力也不盡相同。柳青[25]試驗中，抗氧化酵母DQ-1-2，FQ-7菌懸液清除超氧陰離子自由基能力分別為27.57%和24.97%，均低于本試驗W.anomalus酵母菌的清除率。

圖3 酵母菌菌懸液和無細胞提取物對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.3 Removal of superoxide anions radical by yeast suspension and cell-free extracts

2.1.4 酵母菌抑制脂質過氧化能力

按1.2.4方法，酵母菌抑制脂質過氧化能力結果見圖4。

圖4 酵母菌菌懸液和無細胞提取物的抑制脂質過氧化能力Fig.4 Inhibition of lipid peroxidation by yeast suspension and cell-free extract

由圖 4 可知，W.anomalus QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8菌懸液抑制脂質過氧化能力分別為（144.72±4.53）、（140.32±1.44）、（129.13±2.42）μg/mL，超聲破碎離心后無細胞提取物抑制脂質過氧化能力分別為（80.84±1.67）、（76.66±2.17）、（59.94±2.72）μg/mL。其中菌懸液的脂質過氧化抑制率顯著高于無細胞提取物的脂質過氧化抑制率（p<0.05），W.anomalus QI-1-6菌懸液抑制脂質過氧化能力最好，但與W.anomalus QI-1-7無顯著差異（p>0.05）。原因可能是因為完整細胞活性的酵母菌在抑制脂質過氧化時產生相同的抗氧化物質（如谷胱甘肽、多酚、多糖、酶類），因此抑制脂質過氧化能力也相似。這與陳歷水等對12株酵母菌抑制脂質過氧化能力進行測定的試驗中酵母菌完整細胞活性（49%～75%）高于相應酵母菌提取物（0%～59%）的結果相似[26]。

2.2 不同因素對酵母菌Pb2+吸附能力的影響

2.2.1 pH值對酵母菌吸附Pb2+的影響

不同pH值對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響如圖5所示。

圖5 不同pH值對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響Fig.5 Effect of different pH values on adsorption of Pb2+by W.anomalus QI-1-7

酵母菌在吸附重金屬過程中，pH值的變化會影響官能團結合重金屬離子的能力，因此，pH值是影響酵母菌吸附重金屬的主要因素之一。由圖5可知，在pH值升高的同時，吸附率和吸附量也在增大。具體表現為：當pH值在2.0～3.0區間內，菌株QI-1-7吸附Pb2+的能力較弱；當pH值為5.0時，吸附能力達到最高，且顯著高于其他pH值（p<0.05），此時吸附率和吸附量分別為98.31%、6.55 mg/g。當pH值大于5.0時，吸附率不再隨著pH值的增大而增大，反而呈一個負相關的關系，原因可能是隨著pH值的繼續升高，OH-會和金屬離子競爭菌體表面的結合位點[27]。

2.2.2 不同菌體濃度對酵母菌吸附Pb2+的影響

不同菌體濃度對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響如圖6所示。

圖6 不同菌體濃度對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響Fig.6 Effect of different cell concentration on the adsorption of Pb2+by W.anomalus QI-1-7

由圖6可知，當菌體濃度為9 g/L～17 g/L，菌體吸附率呈先上升后下降的趨勢。當菌體濃度為15 g/L時，吸附率達到最高的98.76%。當菌體濃度為9 g/L時，吸附量最多，為7.96 mg/g，具體表現為：當菌體濃度為9 g/L～15 g/L時，菌株QI-1-7的吸附能力維持在一個較高的水平，吸附量在6.5 mg/g～7.9 mg/g之間；當菌體濃度為17g/L時，吸附量出現顯著的下降（p<0.05）。這種現象出現的原因可能是由于菌體QI-1-7在高的濃度下，部分細胞聚集導致細胞壁中化學反應基團（OH-、COO-和NH3+）之間的內部連接發生羥氨基化和酰胺化反應，從而減少了金屬離子在菌體中的吸附[28]。

2.2.3 初始Pb2+濃度對酵母菌吸附Pb2+的影響

不同初始Pb2+濃度對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響如圖7所示。

圖7 不同初始Pb2+濃度對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響Fig.7 Effect of different initial Pb2+concentrations on the adsorption of Pb2+by W.anomalus QI-1-7

由圖7可知，隨著初始Pb2+濃度的增大，吸附率逐漸下降，反觀吸附量，呈現增長的趨勢。具體表現為：當Pb2+濃度為100 mg/L時，此時吸附率為最大值，達到98.98%；Pb2+濃度為500 mg/L時，吸附率達到最低的49.85%。當Pb2+濃度為100 mg/L時，吸附量最低，為6.60 mg/g，隨著Pb2+濃度的持續升高呈現一個勻速增長的過程，Pb2+濃度增長到500 mg/L時，吸附量達到最高的16.62 mg/g。推測原因可能是：Pb2+濃度為100 mg/L時，菌株QI-1-7表面的結合位點較少，無法與較多的Pb2+進行結合所以吸附量較少；當Pb2+濃度增大到500 mg/L時，菌株QI-1-7表面上的結合位點與Pb2+的結合逐漸趨于飽和，吸附率不再發生顯著變化，此時吸附量最大。本研究與Li等[29]和Wahab[30]的結論基本一致，而Gunjal等[31]的研究發現，隨著Pb2+質量濃度的升高，菌體細胞對Pb2+的吸附量及吸附率均呈現逐漸下降的趨勢，表明不同微生物對Pb2+的吸附能力有差異。

2.2.4 吸附溫度對酵母菌吸附Pb2+的影響

不同吸附溫度對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響如圖8所示。

圖8 不同吸附溫度對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響Fig.8 Effect of different adsorption temperature on the adsorption of Pb2+by W.anomalus QI-1-7

酵母菌QI-1-7在吸附重金屬Pb2+過程中，吸附溫度的變化會影響酵母菌吸附Pb2+的能力。由圖8可知，當吸附溫度為25℃時，對菌株QI-1-7的吸附量和吸附率影響顯著；菌株QI-1-7在35℃時，吸附率與吸附量達到最大值，分別為98.2%和6.55 mg/g，吸附溫度超過35℃之后，隨著溫度的上升，菌株QI-1-7吸附Pb2+的能力呈顯著下降的趨勢。由此可知，酵母菌的最適宜生長溫度為35℃左右，在該溫度下，菌株可以保持較強的吸附能力，不論是溫度升高又或者是溫度降低，都會有一些細胞喪失活性，影響菌株的吸附率以及吸附量。本研究與趙曉峰對兩株高耐鉛菌株E.hirae Qaa和P.pento-saceus Fe3進行的不同溫度下鉛吸附試驗結果一致[32]。

2.2.5 吸附時間對酵母菌吸附Pb2+的影響

不同吸附時間對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響如圖9所示。

圖9 不同吸附時間對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響Fig.9 Effect of different adsorption time on the adsorption of Pb2+by W.anomalus QI-1-7

由圖9可知，吸附時間達到150 min時，菌株QI-1-7吸附Pb2+的吸附率及吸附量達到最高，分別為98.87%和6.59 mg/g，與120 min和180 min時的吸附率及吸附量無顯著差異（p>0.05）。原因可能是菌株QI-1-7的吸附方式為胞外結合。當細胞與Pb2+相接觸時，存在于細胞表面上的活性基團在靜電結合的作用下，開始與Pb2+進行結合，吸附能力會增強，活性基團的結合位點會隨著時間的推移逐漸趨向飽和狀態，此時吸附進入到平穩的狀態，同時也表明，菌株QI-1-7對Pb2+的吸附是一個比較快的過程。

3 結論

W.anomalus QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8 菌懸液和無細胞提取物都具有一定的抗氧化能力，菌懸液抗氧化能力顯著高于無細胞提取物（p<0.05）。W.anomalus QI-1-6菌懸液對DPPH·清除能力較好，達到（144.72±4.53）μg/mL；W.anomalus QI-1-7菌懸液對 DPPH 自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除能力較好，分別達到（85.09±1.11）、（240.88±7.69）、（171.41±6.92）μg/mL。

當pH值為5時，W.anomalus QI-1-7對Pb2+的吸附能力最強，此時吸附率為98.31%；菌體濃度為15 g/L時，吸附率為98.75%；Pb2+濃度為100 g/L時，吸附率為98.97%；溫度為35℃時，吸附率為98.20%；吸附時間為150 min時，菌株QI-1-7對重金屬Pb2+的吸附能力最強，吸附率達到98.87%。