MLST在乳酸菌鑒定及其多樣性分析中的應用

趙塵培，姜琳琳，張建龍，陳國忠，于馨，朱洪偉，張興曉

（魯東大學生命科學學院，山東 煙臺 264025）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類能夠發酵糖類物質最終產物為乳酸的革蘭氏陽性細菌。在細菌分類學上將乳酸細菌分為43個屬，包括373個種及亞種[1]。目前，在食品工業領域應用最多的乳酸菌主要有乳桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬、雙歧桿菌屬及片球菌屬等。這些乳酸菌株可以定植在人和動物的腸道中，發揮免疫調節、抗氧化、降膽固醇及抑菌等功能。其中，乳酸菌在菌株水平上的分化是決定菌株功能差異性的重要因素。因此，在菌株水平上精確鑒定乳酸菌是非常重要的，可消除不同來源菌株對功能的影響。

隨著分子生物技術的發展，基于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）發展起來的許多分子分型方法被用于乳酸菌及其亞種的分類鑒定及種群遺傳進化分析研究。例如，基于16S rDNA測序、脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis,PFGE）、隨機擴增多態性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）以及聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites,CAPs）等技術，對乳酸菌株的特異性鑒定具有重要意義。其中，16SrDNA技術難以區分近緣種或亞種，而其它分子技術依賴于電泳圖譜，對工作量、辨識度、成本及重現性要求較高，使其應用受到局限[2]。而多位點序列分型（multilocus sequence typing,MLST）技術依靠表征菌株不同管家基因位點的等位基因，可以區分不同菌株的序列類型（sequence type,ST）以及克隆復合體（clonal complex,CC），具有較高的區分性，已廣泛用于致病菌的遺傳多樣性分析[3]。近些年該方法開始應用在非致病性食品菌株乳酸菌株的遺傳多樣性、種群結構及微進化研究中。

1 多位點序列分型（MLST）技術

多位點序列分型（MLST）是一種基于多個管家基因部分片段的核苷酸序列分析來區分相同微生物物種分離株的基因分型技術。近幾十年，MLST已經發展成為監測細菌進化及遺傳多樣性的有效技術手段。最初Maiden等應用11個管家基因對107株腦膜炎奈瑟菌的菌株間等位基因多樣性進行比較評估[4]，后來擴展到其它的細菌種類，來監測菌株種群內的基因重組現象，分析細菌種群結構的進化關系。MLST技術已成功被用于了解干酪乳桿菌(Lactococcus casei)、酒類酒球菌(Oenococcus oeni)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)等諸多乳酸菌的群體遺傳結構和進化關系。

1.1 MLST管家基因的確定

MLST用于表征細菌的遺傳多樣性，主要依賴于管家基因選擇及其內部片段的核苷酸序列。管家基因是生物體細胞生命活動過程中穩定表達的一類基因。在MLST研究中，選擇管家基因主要是由于核苷酸序列變異速率相對較慢，多態性相對于其它基因程度低，并且細菌不同菌株間在管家基因內仍具有足夠的變異，在相同基因座上提供足夠數量的獨特等位基因，所以選擇合適的管家基因在MLST中顯得尤為重要。被選擇的管家基因應為長度不短于1 kb單拷貝基因，具有編碼蛋白的功能，并盡量涵蓋整個染色體[5]。不同乳酸菌MLST方案管家基因的選擇及數量見表1。

對于管家基因數量的選擇原則是省時省力，并具有一定的分辨率以保證獲得足夠的序列型。所以綜合考慮，一般6個～10個管家基因基本能夠滿足菌株群體變異分析的要求[14]。如表1所示關于乳酸菌的MLST分析中，管家基因的選擇同樣遵循上述原則。在植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）MLST方案中，設計了7個管家基因[15]，而在親緣關系相近且樣品來源特殊菌株的MLST分析中，例如發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）的研究中，管家基因設計為11個[16]。最后，目標基因的片段長度一般為450 bp左右，通過一些菌株分型的試驗證明，該長度的目的基因足以用來監測物種的變異情況及系統發育關系。當然，隨著高通量測序技術的發展，較長片段的基因檢測已成為可能。在乳酸菌的MLST研究中，為了獲取更多的遺傳信息，人們開始選擇600 bp～700 bp的目的片段[17-18]。

表1 不同乳酸菌MLST方案管家基因的選擇及數量Table 1 Option and quantity of housekeeping genes in different lactic acid bacteria MLST schemes

1.2 MLST結果分析

多位點序列分型（MLST）技術流程圖見圖1。

如圖1所示，MLST技術是以等位基因圖譜和序列分型（ST）為基本分析單位。應用測序技術對目的基因序列進行分析，提交至MLST數據庫進行比對，獲得等位基因編號，所有等位基因的編號組成菌株最終的序列型。可將乳酸菌序列提交至PubMLST及BIGSdb等數據庫。

圖1 多位點序列分型（MLST）技術流程圖Fig.1 Technical flow chart of Multi-site sequence typing(MLST)

在乳酸菌的序列分型中，若管家基因中有最多不超過2個位點等位基因不同，則可以聚集為一個克隆復合體（CC）[19]。例如在Bao等的副干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）MLST方案中，分析定義10個等位基因，確定了71個ST型和25個克隆復合體[7]。運用START、eBURST、MEGA、Sturcture、SplitsTree 等生物信息學分析軟件，對序列進行分析。其中，先利用MEGA軟件進行核苷酸序列比對，獲得等位基因圖譜；START軟件主要分析多態性位點、核酸多態性（π）、G+C含量（%）等；eBURST軟件對ST型進行克隆復合體歸類分析；在Duan的研究中利用eBURST軟件對馬乳酒樣乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）不同 ST型進行分析，確定了具有相同起源的菌株[20]。然后使用Sturcture及SplitsTree軟件對分離菌株的遺傳進化關系和種群結構進行分析。

2 多位點序列分型（MLST）技術在乳酸菌分類中的應用

乳酸菌具有較高的物種多樣性，在食品工業及醫學領域發揮重要作用，其分子水平上的鑒定，對該菌株的種群生物學研究具有重要意義。MLST最初應用于致病菌的進化和種群生物學研究，由于具有較高的分辨能力，已拓展至乳酸菌的多樣性和系統進化分析。目前，MLST已用于乳酸菌的進化和種群結構分析，包括乳桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬等。

2.1 MLST在乳桿菌屬（Lactobacillus）遺傳多樣性分析中的應用

MLST技術在乳桿菌屬中的應用見表2。

新彩繪畫起稿有大致幾個步驟，起圖、升圖、作圖、拍圖、勾勒、上色等。起圖是用單黑水繪制大概紋樣，升圖是用墨水與上勾勒一邊，主要目的是為了畫面更精細，把多余不需要的精細刪減，對于繪制畫面而言是一個提升的過程從而達到最后定稿的目的。作圖是于后在瓷器上復出正稿，拍圖則是需要大量批量，可以重復使用。

表2 MLST技術在乳桿菌屬中的應用Table 2 Application of MLST in Lactobacillus

目前，MLST用于闡明乳桿菌屬的進化和種群結構主要包括植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌、發酵乳桿菌、清酒乳桿菌等。

最初，MLST用于從發酵水果和蔬菜以及青貯飼料、葡萄酒、泡菜和奶酪中分離的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的鑒定。由于受分離株數量的限制，對于植物乳桿菌的遺傳多樣性分析不夠準確。2015年，Xu等采用8個等位基因的MLST技術分析了179株分離自不同地理區域、不同來源的植物乳桿菌及7株參考菌株，涵蓋全部遺傳多樣性和種群物種的結構[11]。結果顯示186株分離株具有73個不同的序列類型（ST），形成 10個克隆復合體（CCs），共有 158個多態性位點。系統發育樹結果表明，來自相同生態位的植物乳桿菌分離株具有相似的遺傳多樣性和種群結構，對乳酸菌的微生態學研究具有重要意義。

2015年，Dan等首次利用MLST技術對203株發酵乳桿菌的11個管家基因進行多樣性分析[8]，研究結果得到57個序列分型（ST），其中27株菌屬于獨立的序列型，表明具有高度的遺傳多樣性；系統發育分析表明，發酵乳桿菌的分離株主要分為兩個主要類群，同一類群中的發酵乳桿菌分離株進化關系較近。另外，Sulaiman等利用MLST技術檢測速食罐頭中的發酵乳桿菌[16]，表明MLST技術中的管家基因可以為發酵乳桿菌的物種鑒定提供依據，并可用于罐頭食品的安全監測項目。

干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌、玉米乳桿菌及副干酪乳桿菌中的其它亞種親緣關系非常近，而傳統的發酵特性很難進行區分，因此需要結合分子生物學技術對菌種進行鑒定。Feng等利用7個管家基因對100株來自西藏自然發酵乳制品的乳酸菌進行多樣性研究，設計并創建了有針對性的MLST方案[23]。另外研究表明，增加dnaK基因可以明顯區分出這4株菌。因此，dnaK基因可以作為干酪乳桿菌的一個附加分子系統發育標記，利用該基因測序可以很容易地解決這些菌株之間的系統發育關系[22]。這對干酪乳桿菌菌株的管理及溯源具有重要意義。

2.2 MLST在鏈球菌屬（Streptococcus）遺傳多樣性分析中的應用

嗜熱鏈球菌被美國食品藥品監督管理（Food and Drug Administration,FDA）認定為鏈球菌屬93個物種中唯一具有“安全”狀態且在酸奶、奶酪和其他乳制品發酵中具有重要作用的菌株[42]。人們對嗜熱鏈球菌的分離與研究工作開始于上個世紀初。最初通過分析對比16S rRNA和超氧化物歧化酶基因，認為嗜熱鏈球菌與唾液鏈球菌親緣關系相近，曾一度被劃為唾液鏈球菌的一個亞種，直到1991年通過DNA-DNA重組試驗才將嗜熱鏈球菌恢復到種的水平。因此，分析嗜熱鏈球菌的多樣性及種群結構對于理解其生態進化及其在工業上應用非常重要。Yu等開發了10個管家基因的MLST分析方案[43]，對不同生態來源和地理區域分離的239株嗜熱鏈球菌和36個全基因組菌株（18株嗜熱鏈球菌，2株前庭鏈球菌和16株唾液鏈球菌）進行遺傳多樣性分析，結果表明，嗜熱鏈球菌分離株的進化與地理位置有一定關系，但與發酵乳制品的類型無關。對36個全基因組菌株（18株嗜熱鏈球菌、2株前庭鏈球菌和16株唾液鏈球菌）進行系統進化分析表明，MLST方案可以清楚地分離唾液鏈球菌的3個密切相關的物種，并且適合于分析種群結構，這對研究不同地理區域的嗜熱鏈球菌菌株之間的系統發育關系具有重要意義。

2.3 MLST在乳球菌屬（Lactococcus）遺傳多樣性分析中的應用

乳酸乳球菌屬（Lactococcus lactis）包含乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp.lactis）、乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis subsp.cremoris）和乳酸乳球菌霍氏亞種（Laclococcus lactis subsp.hordniae）、Laclococcus lactis subsp.tructae 4個亞種。其中，Lactococcus lactis subsp.lactis與 Lactococcus lactis subsp.cremoris在乳制品的發酵生產過程中，尤其是在干酪的生產過程中，發揮重要的作用。所以，從食品工業和科學研究的角度，對這兩個亞種的區分就顯得尤為重要。

3 多位點序列分型技術（MLST）在乳酸菌基因組多樣性分析中的應用

乳酸菌基因組上的遺傳信息具有復雜性和多樣性，而基因的遺傳變異是追溯菌株進化發展的重要依據，因此乳酸菌基因組多樣性也是關注的焦點之一。MLST技術雖然具有分辨率強、精確度高、數據可重復性好、菌株間數據可標準化等優點，但其畢竟只局限于基因組上的個別位點，有可能遺漏一些遺傳信息，導致菌株間的親緣及進化關系存在偏差。隨著分子生物學及高通量測序技術的發展，比較基因組雜交（comparative genome hybridization，CGH）、隨機擴增多態性DNA標記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）等技術成為提高其分辨力的良好補充。

唾液乳酸菌（Lactobacillus salivarius）是人類和動物的口腔及胃腸道中重要的益生菌。盡管從不同環境來源中分離出來較多的唾液乳桿菌，但是關于環境對菌株的基因組多樣性的影響卻缺乏相應的研究。Raftis等為了研究此問題[41]，應用MLST和比較基因組雜交技術（CGH），對來自人、動物或食品中的33株唾液乳桿菌進行基因多樣性分析。MLST技術清晰地分離了人源和動物源菌株，而CGH方法基于對總基因組含量（包括小質粒）的分析，確定了18個主要的基因組變異區域及變異熱點，表明唾液乳酸菌具有高水平的基因多樣性，這些基因揭示了菌株之間具有的特異性特征，包括碳水化合物利用、細菌素及胞外多糖（exopoly saccharides，EPS）的產生，這項研究有助于了解唾液乳桿菌基因組的進化規律與唾液乳桿菌生態位適應和益生潛力之間的關系。

2014 年，González-Arenzana 等研究發現 MLSTPFGE組合方法在30株酒明串珠菌（Oenococcus oeni）菌株鑒定上具有較高的分辨率[47]。MLST揭示了點突變以及少數基因中位點的缺失和突變，而脈沖場凝膠電泳技術（PFGE）對大規模基因組重排更敏感。結果發現，兩種分型方法的組合可以得到最多的基因型數量（22種）及多樣性指數（ID值，0.947），這意味著PFGE和MLST技術組合可能會成為Oenococcus oeni菌株的可靠分型方法。

舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）是中國傳統酸面團中的主要乳酸菌。Yang等通過多位點序列分型（MLST）技術和多重隨機擴增多態性DNA聚合酶鏈反應技術研究來自不同區域的11個中國傳統酸面團中98株舊金山乳桿菌的種內多樣性[12]。MLST揭示了10種不同的序列型（ST），其中6種就包含79.8%的分離株，并且被歸為同一種克隆復合體，表明它們之間進化關系相近。多重RAPD-PCR技術將98株舊金山乳桿菌分離株分為6種類型，相似度為70%。MLST與多重RAPD-PCR相比具有更高的區分能力，但是多重RAPD可以幫助區分同一ST型中的某些菌株。因此，在MLST和多重RAPD-PCR技術組合下，針對不同遺傳變異，獲得了舊金山乳桿菌的最佳基因型特征。

4 展望

近年來，隨著乳酸菌的益生功能的不斷研究，乳酸菌制劑的生產及銷售量日漸增多，因此對乳酸菌菌株的精確鑒定及多態性研究已成為乳酸菌產業化的重要前提。MLST被認為是細菌基因分型技術中的金標準，在乳酸菌的種群結構及其遺傳多樣性的研究方面取得了一定的進展。然而，在過去的幾十年中，MLST主要利用管家基因來進行菌株的分類及鑒定，而對菌株基因多樣性與遺傳背景的相關性缺乏研究。由于乳酸菌的益生功能受不同地理區域、不同來源及不同環境因子的影響，因此，以特定的功能基因為主要標記分子進行乳酸菌遺傳多樣性的分析，可以從不同的寄主和地理位置區分同一種屬的乳酸菌，并可以鑒定與之密切相關的菌株，對乳酸菌益生功能的開發具有重要意義。MLST方法已經發展到基于幾百個基因的核心基因組MLST（core genome MLST）到幾千個基因的全基因組MLST(whole genome MLST)，這種大規模的MLST方案已被證明具有更高的分辨率。所以，可以將MLST技術與其相結合，全面、系統地了解乳酸菌基因組的結構和組成，健全乳酸菌不同種屬的MLST數據庫，促進世界范圍內乳酸菌株的遺傳進化研究。