超高壓處理對太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）腸道菌群的影響

梁山泉，劉枝浩，王敬宇，朱常亮，牟海津

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

牡蠣已在世界各地被廣泛養殖，在滿足人類營養需求和促進漁業經濟發展方面具有巨大價值[1]。然而，牡蠣體內的微生物種類繁多，其中包含著副溶血性弧菌和創傷弧菌等致病微生物，這些致病微生物會帶來食品安全的風險。此外，由于牡蠣的高水分和養分含量可為多種微生物的生長和繁殖提供有利的條件，從而導致牡蠣易腐敗[2]。通過常規培養和高通量測序發現，東部牡蠣（Crassostrea virginica）腸道微生物以變形菌門（Proteobacteria）為主，占了所有細菌的70%以上，此外還包括疣微菌門（Verrucomicrobia）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、柔膜菌門（Tenericutes）和厚壁菌門（Firmicutes）等[3]。太平洋牡蠣（C.gigas）體內的微生物以假單胞菌屬為主，占三分之一以上，其它菌屬包括弧菌屬、不動桿菌屬（Acinetobacter）和氣單胞菌屬[4]。

牡蠣在收獲后會經歷運輸和儲存等工序，在此過程中其體內的微生物多樣性會發生顯著的變化。因此，在消費之前進行有效的處理來減少牡蠣體內微生物是有必要的。近年來，超高壓處理這種非熱加工技術在海產品殺菌方面的研究越來越受到關注，該技術可在不破壞海產品營養成分的前提下[5]，有效抑制細菌的生長繁殖并滅活[6]。LOPEZ-CABALLERO等[7]報道當牡蠣經過400 MPa處理10 min后，大腸桿菌、產H2S的細菌和總活菌數可減少到檢測閾值以下。HE等[8]研究表明高靜水壓處理后的牡蠣在存儲過程中（3℃超過27 d）細菌總數保持在較低的水平。從260 MPa處理后的牡蠣中分離出的細菌主要是腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrifaciens）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。而經過500 MPa或800 MPa處理的牡蠣則主要為假單胞菌屬[9]。CAO等[10]發現高靜水壓處理可極大地改變牡蠣在冷藏過程中腐敗菌群的組成，經300 MPa處理2 min的變質牡蠣中以嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）（42.3%）為主，而交替假單胞菌屬（32.2%）和希瓦氏菌屬（19.5%）在未經高靜水壓處理的變質牡蠣中占主導地位。在這些研究中，有關超高壓處理的大多數報道都集中在致病微生物的滅活和牡蠣整體菌群的變化。牡蠣腸道是牡蠣體內微生物主要存在的部位之一，目前并沒有關于超高壓處理對牡蠣腸道菌群影響的報道。

本試驗通過16S rRNA測序方法對100、200 MPa和400 MPa超高壓處理5 min的牡蠣腸道進行菌群結構的分析，探究超高壓與菌群的相關性，為利用超高壓技術在防控牡蠣體內致病微生物的實際應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）：青島市團島農貿市場；RNA提取試劑盒：美國Omega Bio-tec公司；瓊脂糖：西班牙Biowest公司；FastPfu高保真DNA聚合酶：中國TransGen公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒：美國Axygen公司；NEXTFLEX DNA測序建庫試劑盒：美國Bioo Scientific公司；MiSeq基因測序試劑盒：美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

L1-600/10超高壓設備：天津華泰森淼生物科技有限公司；N13462C移液器、5424 R高速臺式冷凍離心機：德國Eppendorf公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計：美國Thermo Fisher Scientific公司；ELx800酶標儀：美國Biotek公司；QL-901渦旋混合器：海門其林貝爾儀器制造有限公司；GeneAmp9700型PCR儀：美國ABI公司；NextSeq 500測序儀：美國Illumina公司；QuantiFluorTM-ST微型熒光計：美國Promega公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 新鮮牡蠣的采集與處理

將牡蠣用自來水沖洗干凈，單個封裝放進高溫蒸煮袋中。之后進行超高壓處理，具體流程：100、200、400 MPa處理5 min，其中升壓速度為20 MPa/s，泄壓時間可忽略不計。樣品處理完之后迅速在冰上用無菌手術刀取出腸道內容物，放入液氮固定10 min后置于-80℃冰箱中待用。

1.3.2 RNA的提取與質量分析

根據RNA試劑盒的說明書進行RNA抽提；超微量分光光度計檢測提取的RNA濃度和純度；之后用反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉成cDNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA和cDNA的質量，用338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACH VGGGTWTCTAAT）引物對V3～V4可變區進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。

1.3.3 高通量測序

本部分由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用DNA凝膠回收試劑盒進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用微型熒光計進行定量檢測。根據Illumina MiSeq平臺標準操作規程將純化后的擴增片段構建雙端測序的文庫。構建文庫步驟如下。

1）連接“Y”字形接頭。

2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段。

3）利用PCR擴增進行文庫模板的富集。

4）加入氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。

利用Miseq PE300平臺進行測序。原始數據上傳至美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫中。

1.3.4 生物信息學分析

本部分也由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。原始測序序列使用Trimmomatic軟件質控，使用FLASH軟件進行拼接。

1）設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20 bp，從窗口前端位置截去該堿基后端所有序列，之后再去除質控后長度低于50 bp的序列。

2）根據重疊堿基overlap將兩端序列進行拼接，拼接時overlap之間的最大錯配率為0.2，長度需大于10 bp。

3）根據序列首尾兩端的barcode和引物將序列拆分至每個樣本，barcode需精確匹配，引物允許2 bp的錯配，去除存在模糊堿基的序列。使用的UPARSE軟件（version 7.1，http：//drive5.com/uparse/），根據 97%的相似度對序列進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數據庫（SSU123），設置比對閾值為70%。

2 結果與分析

2.1 新鮮牡蠣腸道菌群多樣性分析

新鮮牡蠣腸道菌群的檢測結果如表1所示。

表1 牡蠣腸道菌群中檢測到的主要屬Table 1 Major bacterial genus detected in the gut microbiota of fresh oyster

續表1 牡蠣腸道菌群中檢測到的主要屬Continue table 1 Major bacterial genus detected in the gut microbiota of fresh oyster

新鮮牡蠣腸道菌群主要包括擬桿菌門（Bacteroi-detes，21%）、Epsilonbacteraeota（1%）、厚壁菌門（4%）、梭桿菌門（Fusobacteria，6%）、變形菌門（43%）和柔膜菌門（22%）；在主要屬（至少一個樣品中占整個群落的1%）中，弧菌屬最多，其次是支原體屬（Mycoplasma）和Roseimarinus屬，其它的還有葡萄球菌屬、丙酸菌屬、氣單胞菌屬、Psychrilyobacter、油螺旋菌屬和黃單胞菌屬。

PIERCE等[3]分析了東部牡蠣的菌群多樣性，發現在門水平上主要以變形菌門、柔膜菌門、厚壁菌門等為主；曹榮等[11]采用了高通量測序方法分析牡蠣的微生物群落，結果發現在目的分類水平上，弧菌目（Vibrionales，49.3%）、交替單胞菌目（Alteromonadales，12.2%）占優勢；在科的分類水平上，主要是弧菌科（Vibrionaceae，36.8%）、希瓦氏菌科（Shewanellaceae，10.3%）和交替假單胞菌科（Pseudoalteromonadaceae，7.2%）；在屬的分類水平上，弧菌屬（28.3%）、希瓦氏菌屬（10.3%）、交替假單胞菌屬（7.2%）比例相對較高。這些報道與本研究的結果相似。

2.2 超高壓處理對牡蠣腸道菌群結構的影響

超高壓處理后，對牡蠣腸道菌群進行了多樣性分析，結果見表2。Chao1指數和ACE指數表征微生物總物種的數量，Shannon指數代表細菌群落的多樣性。

表2 超高壓處理后牡蠣腸道菌群多樣性的變化Table 2 Effect of UHP treatment on the diversity of oyster gut microbiota

由表 2 可知，與 0.1MPa（對照組）相比，100、200MPa和400 MPa組的Chao1和ACE指數有所提高，但是沒有達到顯著水平，這表明超高壓處理可以使牡蠣腸道菌群的總量有所變化。經過超高壓處理后，Shannon指數有所下降，這表明超高壓處理可以使牡蠣腸道菌群的多樣性降低。而且4個組的測序覆蓋率都大于0.99，表明檢測數據可信。

為了解不同壓強的超高壓處理后牡蠣腸道中的菌群結構發生的變化，分析了牡蠣腸道菌群的Shannon稀釋曲線、Sobs稀釋曲線、聚類分析和主成分分析，結果如圖1所示。

從圖1a可以看出對照組（0.1 MPa）和200 MPa的距離較遠。經過超高壓處理后，如圖1d所示，腸道菌群的PC1和PC2都發生了很大的變化。此外，由聚類分析可知，與對照組相比較，經過超高壓處理后牡蠣腸道菌群結構發生改變，而且隨著壓強的升高，這種差異越來越大。

圖1 超高壓處理對牡蠣腸道菌群結構的影響Fig.1 Effect of UHP treatment on the structure of oyster gut microbiota

為更深入地了解超高壓處理后牡蠣腸道菌落結構發生的變化，在門水平進行了分析，具體見圖2。

圖2 超高壓處理前后牡蠣腸道菌群在門水平上的相對豐度Fig.2 Relative abundance of oyster gut microbiota at the phylum level before/after UHP treatment

由圖2a可知，在門水平上，牡蠣腸道中主要的優勢菌門為變形菌門、擬桿菌門、柔膜菌門、厚壁菌門、Epsilonbacteraeota和梭桿菌門6個門。由圖2b～圖2d可知，與對照組相比，超高壓處理對變形菌門、擬桿菌門和柔膜菌門的相對豐度產生了很大的影響。其中超高壓處理顯著增加了擬桿菌門的相對豐度，與對照組相比，400 MPa組中擬桿菌門的相對豐度升高了57.31%。100 MPa和200 MPa組擬桿菌門的相對豐度則分別升高了5.77%和0.69%。與對照組相比，超高壓處理顯著降低了柔膜菌門的相對豐度，經過100、200 MPa和400 MPa處理后柔膜菌門的相對豐度分別降低21.94%、21.07%和22.16%。變形菌門的相對豐度在經過100 MPa和200 MPa處理后有所升高，而當壓強升高到400 MPa時，其相對豐度卻顯著下降了23.90%。

牡蠣腸道中變形菌門、擬桿菌門和柔膜菌門是三大優勢菌[3，10]。變形菌門細菌都為革蘭氏陰性菌，且包括很多致病細菌，如大腸桿菌、沙門氏菌和霍亂弧菌等。超高壓處理是一種很有效的殺滅致病菌的加工方式[12]，CAO等[10]研究發現牡蠣經過300 MPa處理2 min后變形菌門的相對豐度由77.5%下降到60.0%。由此表明超高壓處理后牡蠣腸道菌群趨向于健康的方向發展。

為更進一步了解超高壓處理對牡蠣腸道優勢菌群的影響，在科水平和屬水平上進行了分析，結果如圖3所示。

圖3 超高壓處理前后牡蠣腸道科水平和屬水平優勢菌群Fig.3 Dominant gut microbiota of oyster at the family level and genus level before/after UHP treatment

由科水平上的相對豐度（圖3a）可知，超高壓處理后，各組腸道菌群在科水平上主要分為黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、弧菌科、Nitrincolaceae、支原體科（Mycoplasmataceae）、Cryomorphaceae、 葡 萄 球 菌 科（Staphylococcaceae）、紅桿菌科（Rhodobacteraceae）、Prolixibacteraceae、黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）、氣單胞菌科（Aeromonadaceae）和梭桿菌科（Fusobacteriaceae）12個科。在對照組中，弧菌科、支原體科、Prolixibacteraceae和梭桿菌科的占比較大；100 MPa組和200 MPa的腸道菌群組成較為相似，其中黃桿菌科、Nitrincolaceae和葡萄球菌科的占比較大；而400 MPa組的腸道菌群變化最為明顯，其腸道菌群主要由黃桿菌科組成，占比超過70%。由圖3b可以看出，各組腸道菌群在屬水平上主要分為Pseudofulvibacter、弧菌屬、Amphritea、葡萄球菌屬、支原體屬、Roseimarinus、黃單胞菌屬、氣單胞菌屬、Pseudophaeobacter、Psychrilyobacter、Flaviramulus、黃桿菌屬（Flavobacterium）、 極 地 桿 菌 屬 （Polaribacter）和Tenacibaculum等14個屬。在對照組中，弧菌屬、支原體屬和Roseimarinus占比較大；100 MPa組中，Pseudophaeobacter占比最大；而200 MPa組和400 MPa的腸道菌群變化較大且這兩組的菌群組成也較為相似，主要以黃桿菌屬、氣單胞菌屬、葡萄球菌屬、黃單胞菌屬和Amphritea為主。CRUZ-ROMERO等[9]報道260 MPa超高壓處理的牡蠣中分離出的細菌是惡臭希瓦氏菌和熒光假單胞菌，而經過500MPa處理后牡蠣中主要的微生物是芽孢桿菌屬（Bacillus）、微球菌屬（Micrococcus）、Alcaligenes、 葡 萄 球 菌 屬 、 莫 拉 氏 菌 屬（Moraxella）和不動桿菌屬。

2.3 超高壓處理對牡蠣腸道的顯著菌群影響

為更清楚地了解超高壓處理后牡蠣腸道中具體哪些菌群發生了顯著的變化，本研究采用了LEfSe分析，結果見圖4。

圖4 LEfSe分析100、200、400 MPa和對照組之間在屬水平上的顯著差異菌群Fig.4 The significantly different flora between control group and 100 MPa，200 MPa，400 MPa at the genus level identified by LEfSe analysis

經過100 MPa處理后，在屬水平上，弧菌屬、嗜冷菌屬（Psychrilyobacter）、支原體屬、梭桿菌屬（Fusobacterium）、OM43_clade和 Labilibacter的相對豐度顯著降低。而經過100 MPa處理后，Kordiimonas、Aquimarina和極地桿菌屬（Polaribacter）的相對豐度顯著增加（圖4a）。經過200 MPa處理后，支原體屬、OM43_clade和Labilibacter的相對豐度顯著降低，這與100 MPa處理后的變化一致。而海洋桿菌屬（Oceanobacillus）、Aquimarina、扭鏈瘤胃球菌屬（Ruminococcus__torques）、副球菌屬（Paracoccus）、Vogesella、Pajaroellobacter、微球菌屬、Clostridium_sensu_stricto、Neptuniibacter和食酸菌屬（Acidovorax）的相對豐度顯著增加（圖4b）。經過400MPa處理后有54種顯著差異菌，其中21種菌屬的相對豐度顯著降低，33種菌屬的相對豐度顯著增加。在顯著降低的菌屬中，除了弧菌屬、支原體屬、Psychrilyobacter、OM43_clade 和 Labilibacter之外，還有葡萄球菌屬、氣單胞菌屬、黃單胞菌屬、腸球菌屬、火色桿菌屬（Flammeovirga）、氣球菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬（Weissella）、水棲菌屬（Enhydrobacter）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、硫磺單胞菌屬（Sulfurospirillum）、Tepidimicrobium 和類香味菌屬（Myroides）等。而顯著增加的菌屬中，除了極地桿菌屬、Aquimarina、副球菌屬外，黃桿菌科的Pseudofulvibacter、Flaviramulus、黃桿菌屬、極地桿菌屬（Polaribacter）、Tenacibaculum、Flavicella、Olleya、Maribacter、Algibacter、Kriegella、Arenibacter、噬纖維菌屬（Cellulophaga）、Pricia和 Muricauda等菌屬的相對豐度顯著增加；紅桿菌科的Loktanella、Sulfitobacter、Aliiroseovarius、Lentibacter、Jannaschia、Pseudophaeobacter和Planktotalea的相對豐度也顯著增加（圖4c）。

弧菌屬是一種廣泛存在于水環境中的革蘭氏陰性細菌，在牡蠣養殖水體中較為常見，包含多種食源性致病微生物，霍亂弧菌、創傷弧菌和副溶血性弧菌是其中最常見的致病微生物[13]；梭桿菌屬可能與炎癥性腸病相關，包括潰瘍性結腸炎和克羅恩氏病，其豐度的增加會導致疾病的發生[14-15]；葡萄球菌屬廣泛分布在各種環境中，包括人和動物的皮膚和黏膜以及土壤、沙子和水，并可引起食源性疾病，如金黃色葡萄球菌（S.aureus）[16]；氣單胞菌屬廣泛存在于淡水、魚類和貝類中，是常見的食源性致病微生物，可引起自限性腹瀉，其中兒童是最易受感染的人群[17]；腸球菌屬是重要的人類病原體，如最常見的人類分離株糞腸球菌（E.faecalis）和屎腸球菌（E.faecium），可引起尿路、腹內、骨盆和傷口感染[18]；類香味菌屬是常見于環境來源的細菌，例如水和土壤，同時也是一種病原微生物，傾向于侵染免疫功能低下的宿主[19]；氣球菌屬是成簇生長的革蘭氏陽性細菌，被認為是一種人類病原體，可引起尿路感染和敗血癥[20]。經過超高壓處理后，這些致病菌屬的相對豐度顯著降低，而且僅經過100 MPa處理5 min后，弧菌屬和梭桿菌屬相對豐度就有大幅的降低，表明超高壓處理能有效減少牡蠣腸道中的有害微生物。

除此之外，試驗還發現經過超高壓處理后的牡蠣未發現（或相對豐度<0.1%）牡蠣中常見的腐敗微生物，如交替假單胞菌屬和希瓦氏菌屬。交替假單胞菌屬和希瓦氏菌屬可使水產品在貯藏過程中產生不良氣味，已被證實是多種水產魚類和貝類低溫貯藏過程中的特定腐敗菌[11，21]。因此，超高壓處理還能降低牡蠣在貯存過程中發生腐敗的風險，并且有助于改善牡蠣的貯藏品質，延長貨架期。

Kordiimonas包含棒狀、嚴格需氧的耐鹽細菌，存在于海洋沉積物中[22]。Aquimarina的細菌均從海水、沉積物、海膽和海洋海綿中分離出來，表明該屬的成員廣泛分布于海底環境中[23]。海洋桿菌屬、副球菌屬、Vogesella、Pajaroellobacter、Neptuniibacter 和微球菌屬大多分布于海洋環境中，具有較好的耐壓性[24-27]。黃桿菌科的微生物廣泛分布于海洋環境中，如嗜冷黃桿菌（F.psychrophilum）和柱狀黃桿菌（F.columnare），以及包含許多具有環境和生物技術意義的細菌[28]。同樣，紅桿菌科的微生物也大多分布于海洋中，而且紅桿菌科的微生物是地球生物化學循環的關鍵參與者，在遠洋環境中占細菌群落的30%，并且通常與真核生物共生[29]。超高壓處理后，上述這些海洋源菌屬的相對豐度顯著增加，表明了海洋源的微生物具有一定的耐高壓的能力。海洋微生物所處的環境中有高壓的存在，在長期的進化中這些微生物已經適應了在一定壓強的環境下存活，所以短時間超高壓處理并不能很好地殺滅這部分微生物。

3 結論

超高壓技術目前作為非熱殺菌成為牡蠣高品質加工的重要趨勢，但該技術對處理后牡蠣體內菌群輪廓不清晰、保證牡蠣產品安全性的超高壓技術參數不全面。針對這些問題，本文主要研究了100、200 MPa和400 MPa處理5 min對牡蠣腸道菌群多樣性的影響。首先分析了牡蠣腸道菌群的結構變化，然后分析了高靜水壓對牡蠣腸道菌群在門、科和屬水平上的變化，最后通過LEfSe分析顯著變化的腸道菌群。研究結果表明，超高壓處理可使牡蠣腸道菌群的總量有所變化，降低腸道菌群的多樣性。超高壓處理更有利于弧菌、氣單胞菌等致病菌相對豐度的減少，100 MPa、5min的處理即可達到顯著降低致病菌相對豐度的效果，從而有效降低牡蠣的食用風險。此外，超高壓處理后能有效殺滅水產品中常見的腐敗微生物，如交替假單胞菌屬和希瓦氏菌屬，從而降低牡蠣在貯存過程中發生腐敗的風險，并且有助于改善牡蠣的貯藏品質，延長貨架期。海洋源的菌屬表現出很好的耐壓性，400 MPa、5 min處理的牡蠣腸道菌群主要由黃桿菌科組成，占比超過70%。