桂花子提取物體外抗氧化和抑菌活性的研究

趙叢叢，管慶林，王濤，周艷玲

（曲靖師范學(xué)院，云南 曲靖 655011）

桂花（Osmanthus fragrans）屬于木犀科木犀屬植物[1]，桂花子性溫，橢圓形，成熟后果皮為紫黑色[2]，近年來，學(xué)者開始關(guān)注桂花子的化學(xué)成分[3]，尹偉等從其醇提溶液的乙酸乙酯萃取部分分離并鑒定出23個(gè)化合物[4]，唐偉卓等[5]從金桂種子醇提取物中分離出12個(gè)化合物，并對(duì)桂花種子脂肪酸成分進(jìn)行分析，趙彩屹等從桂花果油脂中鑒定出9種脂肪酸，不飽和脂肪酸含量高達(dá)83.25%[3]，劉東陽從桂花子中提取分離出環(huán)烯醚萜苷[2]，甘典華對(duì)桂花果皮黑色素進(jìn)行了研究[6]。綜合前人研究，桂花子中含有黃酮類、多糖類、萜類、色素、脂肪酸等[4-10]化學(xué)成分。藥理活性表明，桂花子具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗抑郁、抑制血小板聚集等藥理作用[11-14]。

黃酮類化合物是兩個(gè)苯環(huán)通過中央三碳鏈連接的一系列化合物[15]，多糖是一類重要的天然大分子物質(zhì)[16]，黃酮類和多糖類化合物因具有抗氧化性、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性[17]而備受關(guān)注，多種黃酮類化合物表現(xiàn)出較好的抗菌活性[18]。

我國擁有大量的桂花資源，目前主要是對(duì)桂花進(jìn)行開發(fā)，對(duì)桂花子則未加以利用，對(duì)桂花子中化學(xué)成分的抗氧化活性和抑菌活性研究甚少，造成了資源浪費(fèi)和部分污染。本研究從桂花子中提取黃酮類化合物和多糖類化合物，并進(jìn)行抗氧化活性和抑菌活性的評(píng)價(jià)，以期為桂花子提取物的保健功能應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桂花子：采自曲靖師范學(xué)院校內(nèi)（2018年）；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌：上海魯微科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：南京奧多福尼生物科技有限公司；DPPH、ABTS：sigma公司；硝酸鋁、無水乙醇、抗壞血酸、過硫酸鉀、H2O2、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、苯甲酸鈉、正丁醇、石油醚、硫酸亞鐵、水楊酸、甲醇、氯仿（分析純）：天津試劑公司三廠。

牛肉膏蛋白胨：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂25g，水1 000 mL，pH7.4～7.6，121℃高壓滅菌30 min。

LB液體培養(yǎng)基：25 g LB肉湯，加入1 000 mL蒸餾水，加熱攪拌至完全溶解，121℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外可見分光光度計(jì)：上海昂拉儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海析達(dá)儀器有限公司；DHG-9245電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海微川精密儀器有限公司；WK-600A小型高速粉碎機(jī)：成都市天一元機(jī)械設(shè)備有限公司；NSKY-100C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：西安遠(yuǎn)艦儀器設(shè)備有限公司；GNP-9160恒溫培養(yǎng)箱：常州普天儀器制造有限公司；YXQ-LS-75G立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桂花子的脫色處理

桂花子在50℃下烘干，粉碎后過60目篩，用石油醚索氏回流脫色處理至無色，溫度為50℃，時(shí)間6 h左右。

1.3.2 桂花子黃酮的提取與測定

取脫色后的桂花子，以60%乙醇為溶劑，在料液比為 1∶55（g/mL），85 ℃條件下提取 4.5 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇得粗提物[19]。以甲醇溶解粗提物，減壓回收甲醇，得桂花子黃酮樣液，待測定。參照文獻(xiàn)方法[20]繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=0.263 4x-0.002 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，在試驗(yàn)范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，經(jīng)測定桂花子黃酮樣液濃度為10.87 mg/mL。

1.3.3 桂花子多糖的提取與測定

取脫色后的桂花子，以蒸餾水為溶劑，在料液比為1∶30（g/mL），溫度為 70℃的條件下回流提取 3.5 h，減壓抽濾得多糖粗提液。Sevag法去蛋白[21]，將除過蛋白的多糖溶液旋蒸后量取體積，加入3倍體積的無水乙醇，冷藏過夜。5000r/min條件下離心15min，少量蒸餾水溶解沉淀，得桂花子水提物多糖，待測定。參照文獻(xiàn)[9]方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=6.266 7x+0.0127，R2=0.999 3，在試驗(yàn)范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，經(jīng)測定桂花子多糖樣液濃度為1.95 mg/mL。

1.3.4 抗氧化活性

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的測定

參考文獻(xiàn)方法稍作改動(dòng)：準(zhǔn)備若干支潔凈干燥的25 mL比色管，將2.5 mL的0.004%DPPH甲醇溶液，分別加入到1.5 mL不同濃度的VC甲醇樣品溶液、黃酮甲醇樣品溶液、多糖蒸餾水樣品溶液，于28℃恒溫水浴30 min，515 nm快速測定吸光度，蒸餾水作空白，每支試管做3次平行。

DPPH 自由基清除率/%=（1-A1/A0）×100

式中：A0為空白組的吸光度；A1為加入樣品溶液的吸光度。

1.3.4.2 羥自由基清除能力的測定

參考文獻(xiàn)[22]方法稍作改動(dòng)：取25 mL比色管若干，依次加入9 mmol/L硫酸亞鐵溶液1.0 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.0 mL、1.5 mL不同濃度的VC甲醇樣品溶液、黃酮甲醇樣品溶液、多糖蒸餾水樣品溶液，空白組用蒸餾水代替，加入8.8 mmol/L過氧化氫溶液1.0 mL啟動(dòng)反應(yīng)，蒸餾水補(bǔ)足反應(yīng)總體積為15 mL，混勻后將試管迅速移入37℃水浴鍋中，靜置30 min后于510 nm波長下測定不同濃度樣品液的吸光度。由于樣品本身具有吸光度，測定時(shí)用蒸餾水代替過氧化氫溶液。

羥自由基清除率/%=1-（A1-A2）/A0×100

式中：A0為空白組的吸光度；A1為加入樣品溶液后的吸光度；A2為用蒸餾水代替H2O2后的吸光度。

1.3.4.3 ABTS+自由基清除能力的測定

參考文獻(xiàn)方法[23]稍作改動(dòng)：7.4 mmol/L的ABTS溶液和2.6 mmol/L的K2S2O8溶液等體積混合，25℃～28℃條件下黑暗處放置12 h～16 h，然后用甲醇稀釋40倍～50倍，測量 A734=0.7±0.02，得 ABTS 工作液。25 mL比色管中依次加入3mL工作液、1mL無水乙醇，振蕩10s充分混合，靜置6 min在734 nm處測得A0。取3 mL工作液加入比色管后再加入1mL不同濃度的樣品溶液，振蕩10 s充分混合，靜置6 min在734 nm下測得A1。

ABTS+自由基清除率/%=（A0-A1）/A0×100

式中：A0為空白組的吸光度；A1為加入樣品溶液后的吸光度。

1.3.5 抑菌活性測定

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)后，結(jié)果表明桂花子多糖對(duì)3種試驗(yàn)菌沒有抑菌效果，因此研究的為桂花子黃酮的抑菌活性。

供試菌種的活化及菌懸液的制備：參照文獻(xiàn)[24]的方法使供試菌種活化，菌懸液濃度約為106CFU/mL～107CFU/mL。

抑菌試驗(yàn)-牛津杯法：參照文獻(xiàn)[24]的牛津杯法，用無菌水作空白對(duì)照，每一個(gè)孔中注入300 μL黃酮樣液，37℃下培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑，取平均值。直徑大于0.9 cm抑菌圈為有顯著抑菌效果，小于0.6 cm為無抑菌效果，抑菌圈直徑在0.6 cm～0.9 cm之間為有一定抑菌作用。研究不同濃度的桂花子黃酮及pH值對(duì)其抑菌效果的影響。

最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）-二倍稀釋法[24]：參照文獻(xiàn)的二倍稀釋法，試管中分別加入 0、0.25、0.5、1、2、4 mg/L 不同濃度的桂花子黃酮溶液1 mL，對(duì)應(yīng)試驗(yàn)菌0.1 mL，于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，以完全無菌生長的最高稀釋度為最低抑菌濃度（MIC），研究桂花子黃酮的抑菌作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性

2.1.1 DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果

以VC作對(duì)照，不同濃度桂花子黃酮和多糖對(duì)DPPH自由基清除效果如圖1所示。

由圖1可知，不同質(zhì)量濃度桂花子多糖和黃酮對(duì)DPPH自由基的清除效果均隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，說明桂花子黃酮和多糖作為自由基清除劑與DPPH自由基發(fā)生了反應(yīng)。結(jié)果表明，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.08、0.10 mg/mL時(shí)，黃酮對(duì)DPPH自由基清除效果與同濃度的VC相當(dāng)；多糖對(duì)DPPH自由基清除效果較弱，最高清除率為55.8%。綜上，對(duì)DPPH自由基的清除能力順序?yàn)椋篤C>黃酮>多糖，桂花子黃酮和多糖提取物都有一定的DPPH自由基清除能力，桂花子黃酮較多糖對(duì)DPPH自由基有更強(qiáng)的清除能力。

圖1 對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig.1 Results of DPPH scavenging free radical activity

2.1.2 羥自由基清除能力的測定結(jié)果

對(duì)羥自由基的清除效果見圖2。

圖2 對(duì)羥自由基的清除效果Fig.2 Results of OH scavenging free radical activity

由圖2可知，桂花子多糖和黃酮提取物對(duì)羥自由基的清除能力均隨樣品質(zhì)量濃度的增大先增大后趨于平緩。多糖質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL～1.0 mg/mL時(shí)，多糖溶液對(duì)羥自由基清除率為17.9%～48.5%，黃酮質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL～1.0 mg/mL，黃酮溶液對(duì)羥自由基清除率為22.7%～40.3%。結(jié)果表明，當(dāng)黃酮和多糖質(zhì)量濃度在0.5 mg/mL以下時(shí)，黃酮和多糖對(duì)羥自由基的清除率與VC比較接近，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.5 mg/mL后，黃酮和多糖對(duì)羥自由基的清除率與VC相差較多，原因是高濃度時(shí)，黃酮、多糖對(duì)羥自由基的捕捉能力遠(yuǎn)不如VC。清除能力順序?yàn)椋篤C>多糖>黃酮，桂花子黃酮和多糖對(duì)羥自由基有一定的清除能力。

2.1.3 ABTS+自由基清除能力的測定

以VC作對(duì)照，不同濃度桂花子黃酮和多糖對(duì)ABTS+自由基清除效果如圖3所示。

圖3 對(duì)ABTS+自由基的清除效果Fig.3 Results of ABTS+scavenging free radical activity

由圖3可知，不同濃度桂花子多糖和黃酮質(zhì)量濃度對(duì)ABTS+自由基的清除效果均隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。對(duì)ABTS+自由基的清除能力順序?yàn)椋篤C>黃酮>多糖，多糖溶液、黃酮溶液、VC對(duì)ABTS+自由基最高清除率為77.9%、93.4%、98.3%，黃酮和VC對(duì)ABTS+自由基的清除能力比較接近，是由于VC和黃酮對(duì)ABTS+自由基的捕捉能力接近。多糖對(duì)ABTS+自由基清除能力強(qiáng)于對(duì)DPPH自由基的清除能力，最高清除率為77.3%。因此說明桂花子黃酮和多糖對(duì)ABTS+自由基有較強(qiáng)的清除能力。

2.2 抑菌活性

2.2.1 黃酮濃度對(duì)抑菌效果的影響

不同濃度桂花子黃酮的抑菌效果如圖4所示。

圖4 黃酮濃度對(duì)抑菌效果的影響Fig.4 Effect of flavonoid concentration on antibacterial effect

由圖4可知，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性隨著黃酮質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，黃酮質(zhì)量濃度為0.68 mg/mL～2.72 mg/mL時(shí)，不同濃度黃酮溶液對(duì)3種菌的抑菌效果明顯上升，黃酮質(zhì)量濃度為2.72 mg/mL～10.87 mg/mL時(shí)，不同濃度黃酮溶液對(duì)3種菌的抑菌效果逐漸趨于平緩，黃酮質(zhì)量濃度在0.68 mg/mL～10.87 mg/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑在0.99 cm～1.22 cm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在0.9 cm～1.27 cm，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑在0.92 cm～1.35 cm。結(jié)果表明，桂花子黃酮對(duì)3種菌有顯著的抑菌效果。

2.2.2 pH值對(duì)抑菌效果的影響

將10.87 mg/mL的黃酮溶液，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)pH值，不同pH值黃酮溶液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及枯草芽孢桿菌的抑菌活性如圖5所示。

圖5 pH值對(duì)抑菌效果的影響Fig.5 Effect of pH on antibacterial effect

由圖5可知，當(dāng)黃酮溶液pH值在4～8范圍內(nèi)變化時(shí)，對(duì)3種菌的抑菌圈直徑先增大后減小，金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在pH值為5時(shí)達(dá)到最大，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑在pH值為6時(shí)達(dá)到最大，試驗(yàn)結(jié)果表明，不同pH值的黃酮溶液對(duì)試驗(yàn)菌的抑菌活性不同，且pH值越小，溶液越偏酸性，抑菌效果越好，抑菌圈直徑越大。原因一方面可能是pH值增大會(huì)破壞桂花子黃酮的結(jié)構(gòu)，另一方面可能是pH值增大會(huì)影響菌株的生長，因此酸性條件有利于黃酮的抑菌活性。

2.2.3 桂花子黃酮對(duì)試驗(yàn)菌的最低抑菌濃度（MIC）

最低抑菌濃度的測定結(jié)果見表1。

表1 最低抑菌濃度的測定結(jié)果Table 1 Results of determination of minimum inhibitory concentration

由表1可知，桂花子黃酮溶液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌均具有較好的抑菌效果。以無菌水作為其空白，苯甲酸鈉為陽性對(duì)照，桂花子黃酮的抑制作用表現(xiàn)為：對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.5 mg/mL，低于苯甲酸鈉的最低抑菌濃度0.625 mg/mL；對(duì)枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度為0.25 mg/mL，明顯低于苯甲酸鈉的最低抑菌濃度1.25 mg/mL。綜上可知：桂花子黃酮溶液的抑菌活性優(yōu)于苯甲酸鈉，具有成為新型天然防腐劑的潛力。

3 結(jié)論

本研究從烘干粉碎脫色后的成熟桂花子提取黃酮類化合物和多糖類化合物，研究了桂花子黃酮和多糖的體外抗氧化活性，采用抑菌圈法和最低抑菌濃度法研究桂花子黃酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及枯草芽孢桿菌的抑菌活性。桂花子黃酮對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力，多糖對(duì)DPPH自由基清除效果較弱；桂花子黃酮和多糖對(duì)羥自由基有一定的清除能力，但清除能力不如對(duì)DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力；桂花子黃酮和多糖對(duì)ABTS+自由基有較強(qiáng)的清除能力。桂花子黃酮對(duì)3種自由基的清除能力優(yōu)于多糖。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性隨著黃酮質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，在同一黃酮濃度，桂花子黃酮對(duì)3種菌的抑菌效果比較接近。桂花子黃酮對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度低于苯甲酸鈉的最低抑菌濃度，對(duì)枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度明顯低于苯甲酸鈉的最低抑菌濃度。抗氧化活性和抑菌活性的評(píng)價(jià)為桂花子提取物保健功能的應(yīng)用提供了依據(jù)。