梅奇酵母與釀酒酵母混合發酵對火龍果酒風味的影響

李凱婭，毛曦慶，林雪，劉四新，李從發*

（1.海南大學食品科學與工程學院，海南 海口 570100；2.海南大學理學院，海南 海口 570100）

近年來火龍果（Hylocereus undulatus Britt）因其美麗的果形、鮮艷的色澤、獨特的口感以及高營養、低熱值等鮮明特色而產銷兩旺，深受歡迎[1-2]。同時圍繞其開展的深加工品類也不斷涌現，其中以紅肉火龍果為原料而發酵制成的火龍果酒，更是因其較好地保留了其營養成分和天然、艷麗的紫紅色澤，幾乎成為果酒家族的“新寵”[3-4]。然而如何使其酒香如其色澤一樣突出，真正彰顯其果香和發酵香兼備的上乘品質，卻是一個值得深入研究的課題。一般果酒發酵常采用發酵能力強的釀酒酵母菌種，但釀酒酵母一般產香能力有限，且因發酵旺盛易使果酒酒體單薄、風味欠佳。近年來非釀酒酵母在發酵果酒中廣泛應用，因其對風味等感官特性的積極貢獻而越來越受到重視[5]。Andorrá等[6]認為非釀酒酵母在果酒發酵中可以酶解釋放香味物質和芳香化合物，有助于成品葡萄酒的感官更豐富完美。Philippe等[7]報道戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）在發酵中能生成更多的丙酸乙酯、異丁酸乙酯和二氫肉桂酸乙酯。MU?OZ等[8]發現雪利酒陳釀過程中高級醇的生成量與酵母菌菌種有關，貝酵母F12釀造的雪利酒比用釀酒酵母G1釀造的高級醇含量低。Moreira等[9]發現與釀酒酵母單獨發酵相比，季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）與釀酒酵母混合發酵能減少高級醇和重硫酸鹽產量，增加乙酸異戊酯和乙酸乙酯的含量。總之非釀酒酵母參與的果酒發酵，不僅能增加果酒中的香味物質，而且對降低高級醇含量也有十分重要的意義。本課題組前期研制火龍果酒時發現其高級醇含量稍偏高，不利于酒體協調和清爽，本研究首次引入非釀酒酵母進行火龍果酒的混合發酵制備，探討其與單菌種發酵的差異效果，同類研究未見報道。

通過前期篩選，發現一株產香能力較強的梅奇酵母（Metschnikowia agaves）P3-3在菠蘿酒發酵改善香氣方面效果不錯[10]，本文擬選其與商業釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）D254進行混合發酵，以期釀制出風味良好、高級醇含量低、色香味齊美的火龍果酒，為火龍果產業提質增效、延長產業鏈奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

火龍果（金都一號品系）：海南省東方市種植基地。

梅奇酵母（Metschnikowia agaves）P3-3：分離自番木瓜果皮，保存于海南大學食品科學與工程學院菌種保藏中心；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）D254：活性干酵母，購自上海杰兔工貿有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基：2.0%葡萄糖、1.0%酵母膏、0.5%蛋白胨，自然pH值，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

新世紀紫外-可見分光光度計（T6）：北京普析通用儀器有限公司；氣相色譜儀（Agilent7890A）：安捷倫科技有限公司；pH 計（PB-10）、手持糖度儀（PAL-1）：廣州市授科儀器科技有限公司；便攜式密度計（DA-130N）：深圳埃科瑞儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 火龍果酒釀造基本工藝流程

火龍果→榨汁→酶解→成分調整→SO2處理→接種酵母菌→發酵→澄清、過濾、離心→分裝→分析、感官評定

1.3.2 菌種活化和培養

非釀酒酵母P3-3：將斜面菌種接入酵母浸出粉胨葡萄糖培養基液體培養基、25℃振蕩、活化培養24 h，連續二代、備用；釀酒酵母D254：按說明方法，將活性干酵母40℃活化培養30 min。為使后續方法一致，將其接入酵母浸出粉胨葡萄糖培養基，然后同P3-3一樣進行二代活化培養。

1.3.3 火龍果酒的制備工藝

火龍果原汁（pH 4.20、糖度 17.0°Birx）中首先添加60 mg/L焦亞硫酸鈉溶液靜置2 h，然后置40℃水浴中以果膠酶處理3 h使之酶解。以檸檬酸調整pH值至3.70±0.05，以市售白砂糖調整糖度至23°Birx左右。統一處理好的果汁原料以500 mL裝液量分裝到1L錐形瓶中備用。

1.3.4 兩種酵母菌的接種比例

兩種酵母菌接種比例見表1。

表1 兩種酵母菌接種比例Table1 Ratio of two yeast inoculations

1.3.5 火龍果酒常規理化分析

可溶性固形物測定：手持糖度計法；總酸含量測定：根據國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定[11]；酒精度測定：DA-130N便攜式密度計法。

1.3.6 高級醇的測定

參考文獻[12]進行。

1.3.7 揮發性香氣成分測定

火龍果酒的揮發性成分分析，采用頂空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）提取（發酵完成后存放30 d的樣品），氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析。根據文獻CHEN等[13]的方法測定，稍作修改。毛細管柱為 DB-wax（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm），進樣溫度260 ℃；模式：不分流；流量：1 mL/min；柱溫：40℃保持5 min，以5℃/min升至220℃，以20℃/min升至250℃，保持2.5 min；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃。

SPME的條件為萃取頭：65 μm PDMS/DVB 1 cm；溫度：50℃；時間：振蕩15 min，萃取 30 min；振蕩速度：250 r/min；解吸時間：5 min；GC 循環時間：45 min。樣品中加入內標（2-甲基-3-庚酮）進樣。

1.3.8 感官評定

參照標準GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[11]進行適當修改，如表2。

表2 火龍果酒感官評定標準Table 2 Pitaya wine sensory evaluation standards

1.3.9 數據處理與分析

采用SPSS 17.0對試驗數據進行差異顯著性檢驗分析。用Simca-P13.0進行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）分析；采用繪圖軟件Origin 8.5進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 混合發酵對火龍果酒常規理化指標的影響

對梅奇酵母P3-3和釀酒酵母D254采用不同比例進行同時接種的混合發酵研究。發酵期間的常規理化指標見圖1。

由圖1可知，CI-Ⅰ組和D254單菌接種組的糖度和酒精度無明顯差異，但CI-Ⅲ組和P3-3的pH值明顯低于CI-Ⅰ組、CI-Ⅱ組和D254組。總酸在發酵8 d以后含量相對較高，但波動較大，說明該梅奇酵母產酸能力較強、特別是產有機酸（如醋酸類、多羧酸類等）能力較強，這與其后續風味特征也有關聯性[10]。

圖1 混合發酵體系中糖度、酒精度、總酸、pH值的變化趨勢Fig.1 Changes in brix，alcohol content，total acidity and pH value of pitaya wines during mixed fermentation

2.2 混合發酵對火龍果酒高級醇生成量的影響

高級醇類物質是構成果酒風味的一部分，但異丁醇和異戊醇類的高級醇含量過高時常常會有上頭、頭重之類的表現[14-15]。一般高級醇中正丙醇、異丁醇和異戊醇3種醇類可占總高級醇的90%[12]。3種高級醇含量見圖2。

圖2 混合發酵火龍果酒高級醇產生量比較Fig.2 Comparison of higher alcohol production in pitaya wines by mixed fermentation

由圖2可知，P3-3發酵的正丙醇含量顯著高于其它組別，混合發酵的3組之間無顯著差異；CI-Ⅰ組的異丁醇含量最低為45.7 mg/L，顯著低于其它組別；所有組的異戊醇含量無顯著差異。總高級醇含量方面，CI-Ⅰ組和CI-Ⅱ組間無顯著差異，但都顯著低于其它組別。其中CI-Ⅰ組總高級醇含量比D254組降低11.9%，比P3-3組降低11.2%。顯示兩種酵母菌1∶1比例同時接種進行混合發酵的高級醇含量最低，說明非釀酒酵母參與的果酒發酵在控制高級醇含量方面具有積極作用。

2.3 感官評價

對發酵終止且陳釀一個月的火龍果酒，組織10人感官評定小組（4男6女）進行逐一感官評定，見圖3。

圖3 火龍果酒的感官評分Fig.3 Sensory scores of pitaya wines

由圖3可知，CI-Ⅰ組感官評分最高，發酵的火龍果酒悅目協調、有濃郁的酒香，酒體豐滿，具有典型性。

2.4 揮發性香氣成分分析

香氣是決定最終果酒產品風味和品質的重要因素[16]。通過固相微萃取-氣相色譜-質譜（solid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometry，SPMEGC-MS）對感官評分最高的CI-Ⅰ組的主要揮發性風味物質進行分析，結果見表3。CI-Ⅰ組、D254組、P3-3組分別檢測出118、111、116種揮發性物質，顯示CI-Ⅰ組具有較好的揮發性物質豐度。

表3 火龍果酒中的主要揮發性物質Table 3 The main volatile compounds in pitaya wines

火龍果酒中揮發性物質相對含量的比較圖見圖4。

由圖4可知，酯類在CI-Ⅰ組中相對含量為17.1%，P3-3組為15.03%，D254組為15.12%，表明CI-Ⅰ組酯類相對含量最高。酯類種類方面，混合發酵CI-Ⅰ組生成更多種類的酯類風味物質，擁有D254組和P3-3組特有的酯類物質（如異丁酸乙酯和乙酸異戊酯），產生較低的可以釋放不愉快的蠟味物質（十六酸乙酯）和醚味物質（十四烷酸乙酯）。產生水果味的酯類含量最高，主要有異丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸己酯、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯丙酸乙酯等。這可能是由于非釀酒酵母P3-3具有β-葡萄糖苷酶活力，可以水解糖苷鍵釋放香味物質為火龍果酒增香。這與Clemente-Jimenez等[17]、Hu 等[18]和 Sun 等[19]的研究結果一致。

圖4 火龍果酒中揮發性物質相對含量的比較Fig.4 Comparison of volatile compounds in pitaya wines

火龍果酒中揮發性酸的含量和數量均低于醇類和酯類，代表性物質為辛酸和乙酸。CI-Ⅰ組、D254組、P3-3組揮發性酸相對含量分別為4.57%、4.42%、4.86%，無明顯差異。CI-Ⅰ組的醇類物質相對含量和D254組無明顯差異，但P3-3醇類含量和相對含量較低，這可能是由于非釀酒酵母產醇能力弱而導致。揮發性酚對果酒的香氣和風味產生不利影響[20]，混合發酵CI-Ⅰ組含有較低的4-乙基-2-甲氧基苯酚和2，4-二叔丁基苯酚等揮發性酚類物質，對火龍果酒的風味具有積極的作用。

2.5 主成分分析（principal component analysis，PCA）

對3個組別的揮發性成分進行主成分分析，共獲得2個主成分，混合發酵火龍果酒PCA得分圖見圖5。

圖5 混合發酵火龍果酒PCA得分圖Fig.5 PCA score chart of pitaya wines by mixed fermentation

為獲得導致這種顯著差異的代謝物信息，進一步采用最小二乘方判別分析（PLS-DA）對兩組樣本進行統計分析。PLS-DA得分圖見圖6。

圖6 混合發酵火龍果酒PLS-DA得分圖Fig.6 PLS-DA score chart of pitaya wines

進一步采用有監督式方法OPLS-DA進行建模分析，結果得到2個主成分和1個正交成分。OPLS-DA得分圖如圖7所示。

圖7 混合發酵火龍果酒OPLS-DA得分圖Fig.7 OPLS-DA score chart of pitaya wines by mixed fermentation

各組發酵的火龍果酒均處于置信區間內，3組樣本均有明顯的樣本聚集區，且組間的差異顯著大于組內差異，表明單菌發酵和混合發酵之間揮發性成分差異顯著。進一步采用最小二乘方判別分析（PLS-DA）對兩組樣本進行統計分析，并采用OPLS-DA模型的VIP（VIP scores>1）值，并結合 t-test的 P 值（P<0.05）來尋找得到主要差異性表達代謝物主要有：壬酸、己酸、2，4-二羥基苯甲酸、苯丙酸乙酯、辛酸異戊酯、十一酸乙酯、苯甲酸乙酯、己酸己酯、2-癸醇、2-庚醇、壬醛。

3 結論

采用同時接種M.agaves P3-3與S.cerevisiae D254的方式混合發酵釀造火龍果酒，研究了混合發酵方式對火龍果酒高級醇含量和揮發性物質的影響。各組常規理化指標顯示無明顯差異，混合接種火龍果汁且菌種比例為1∶1時，可以明顯降低火龍果酒中高級醇含量，含量為183.10 mg/L，分別比D254、P3-3單菌發酵組降低11.9%、11.2%。CI-Ⅰ組感官評分最高，為88.9分。SPME-GC-MS結果顯示：CI-Ⅰ組、D254組、P3-3組分別檢測出118、111、116種揮發性物質，其中CI-Ⅰ組產生水果味酯類含量最高，酯類相對含量占比最高為17.1%，酯類種類最多，含有較低物質濃度的揮發性酚類物質。可見，同時接種M.agaves P3-3與S.cerevisiae D254且接種比例為1∶1的方式能降低火龍果酒的高級醇含量，增加香氣物質種類并減少不愉快氣味的產生，使得火龍果酒悅目協調、酒體豐滿，具有典型性。對CI-Ⅰ組、D254組、P3-3組的揮發性物質進行差異分析，差異代謝物主要是酯類物質。