響應(yīng)面法優(yōu)化荔枝殼總黃酮提取及抗氧化活性

黎克純，盧建芳，2，韓妝，尹圓夢，劉細(xì)祥，3*

（1.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530006；2.廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室，廣西 南寧 530006；3.廣西多糖材料與改性重點實驗室，廣西 南寧 530006）

荔枝（Litchi chinensis）屬于無患子科植物，是華南地區(qū)的重要亞熱帶水果之一。由于荔枝營養(yǎng)價值高，在中國大量種植，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的65%～70%[1-2]。2018年預(yù)計荔枝總產(chǎn)量高達(dá)288萬噸，比2017年總產(chǎn)量增加近50%[3]。但是荔枝容易發(fā)臭變壞，在儲存和運輸過程中有較高的保鮮要求[4]。荔枝采摘時節(jié)天氣炎熱，如果采后置于常溫環(huán)境下，荔枝因水分損失果實將很快呈褐色甚至腐爛[5-8]。當(dāng)果實失水褐變而失去營養(yǎng)價值后，將直接減少荔枝種植利潤[9-10]。據(jù)統(tǒng)計，荔枝每年因儲運過程中發(fā)臭腐爛而造成的損失總量占荔枝總產(chǎn)量的20%以上[11]，嚴(yán)重影響了荔枝的種植效益。為了提高荔枝種植產(chǎn)業(yè)的效益，有必要將荔枝直接加工生產(chǎn)成易于儲運的荔枝功能食品[12]。但是對荔枝進行食品加工的過程中，會產(chǎn)生大量的廢棄荔枝殼（占果實重的16%左右）[13]，目前荔枝殼處置方式大多為直接丟棄，既浪費資源又污染環(huán)境。研究表明，荔枝殼含有黃酮類、多酚類和多糖類等多種活性成分[14]，具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，目前對于荔枝殼中總黃酮提取工藝及抗氧化性能研究較少[15-17]。因此，有必要進一步研究荔枝殼總黃酮提取工藝及抗氧化活性。本研究以廣西荔枝食品深加工副產(chǎn)物荔枝殼為研究對象，采用乙醇浸提荔枝殼中總黃酮，進而用響應(yīng)面法優(yōu)化和評價乙醇提取荔枝殼總黃酮的工藝條件，并對從荔枝殼中提取的總黃酮進行抗氧化性能評價，以期為提高荔枝種植產(chǎn)業(yè)附加值提供一種新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荔枝：市售；冰乙酸、蘆丁、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇、甲醇、抗壞血酸、二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯乙酸、六水氯化鐵、N-（1-萘基）乙二胺鹽酸鹽、對氨基苯磺酸（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸（分析純）：西隴化工股份有限公司；亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：環(huán)保部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究所。

721型分光光度計：上海元析儀器有限公司；DF-2型集熱式磁力加熱攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮提取

將荔枝殼用粉碎機粉碎后，取1.0 g荔枝殼粉末放入三口燒瓶中，加入乙醇提取液加熱回流提取。提取結(jié)束后，將提取液冷卻至室溫25℃，抽濾、收集濾液并定容。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定提取液中總黃酮含量[18]，并計算總黃酮得率。總黃酮得率的計算公式如下。

總黃酮得率Y/%=（XKV/W）×100

式中：X為提取液總黃酮濃度，mg/mL；K為提取液的稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；W為荔枝殼粉末質(zhì)量，g。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 料液比對總黃酮得率的影響

在提取溫度50℃、提取時間120 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%的條件下，考察改變料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）]對荔枝殼總黃酮得率的影響。

1.2.2.2 提取溫度對總黃酮得率的影響

在料液比 1∶20（g/mL）、提取時間 120 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%的條件下，考察改變提取溫度（20、35、50、65、80℃）對總黃酮得率的影響。

1.2.2.3 提取時間對總黃酮得率的影響

在料液比1∶20（g/mL）、提取溫度50℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%的條件下，考察不同提取時間（50、85、120、155、190 min）對總黃酮得率的影響。

1.2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響

在料液比1∶20（g/mL）、提取溫度50℃、提取時間120 min的條件下，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（10%、20%、40%、60%、80%）對總黃酮得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理[19]，采用響應(yīng)面法進一步優(yōu)化荔枝殼總黃酮提取工藝。試驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert 7.0.0軟件以荔枝殼總黃酮得率為響應(yīng)值進行分析。試驗因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面法試驗因素水平Table 1 Factors and levels for response surface methodology design

1.2.4 荔枝殼總黃酮抗氧化活性的測定

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除試驗方法按照文獻[20]方法進行。用已知總黃酮濃度的荔枝殼提取液，準(zhǔn)確配制6個不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，分別取2.0 mL不同濃度的樣品溶液于6只具塞比色管中，分別加入2.5 mL DPPH（0.1 mmol/L）甲醇溶液，混勻，避光反應(yīng)30 min，測定吸光值A(chǔ)C（λ=517 nm）。同時用純水、VC和BHT代替樣品，按上述步驟，測得純水空白對照的吸光值A(chǔ)0及Vc和BHT陽性對照的吸光值A(chǔ)C。DPPH自由基清除率計算公式如式（1）所示。

式中：A0為空白對照的吸光值；AC為樣品或陽性對照品的吸光值。

1.2.4.2 總還原力的測定

總還原力采用普魯士藍(lán)法測定，具體操作按照文獻[20]中方法進行。用已知總黃酮濃度的荔枝殼提取液，準(zhǔn)確配制6個不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，分別移取1.5 mL不同濃度的樣品溶液于6只具塞比色管中，分別加入1.5 mL pH6.6的磷酸鹽緩沖溶液和1.5 mL鐵氰化鉀（1%）溶液，混勻，在水浴鍋中加熱至50℃后水浴25 min，冷卻后分別加入1 mL三氯乙酸溶液（10%），充分振蕩，離心分離。取其上清液1 mL，加入1 mL三氯化鐵溶液（0.1%）和2 mL純水，混勻，靜置10 min，在波長700 nm處測其吸光值。同時用VC和BHT代替樣品，按上述步驟，測定不同濃度VC和BHT陽性對照的吸光值。

1.2.4.3 亞硝酸鹽清除能力的測定

參考文獻[21]的鹽酸萘乙二胺法，并按HJ479—2017《環(huán)境空氣氮氧化物的測定鹽酸萘乙二胺分光光度法》改進了亞硝鹽濃度的測定方法。分別移取一定量的荔枝殼提取液置于9個25 mL具塞比色管中（定容到 25 mL 時，總黃酮的濃度分別為 0、0.1、0.3、0.5、1、8、16、32、48 mg/L），分別加入 1.00 mL 濃度為 20 mg/L 的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液和一定量的醋酸溶液，在30℃水浴加熱30 min充分反應(yīng)后，加入8 mL按HJ479—2017配制的顯色液并定容到25 mL，顯色后測定其吸光度。同時用VC和BHT代替樣品，按上述步驟，測定不同濃度VC和BHT陽性對照的吸光度。亞硝酸鹽清除率由公式（2）計算而得。

式中：A0為空白對照的吸光值；AC為樣品或陽性對照品的吸光值。

1.2.4.4 超氧陰離子自由基清除能力的測定

試驗方法參照文獻[21]中的鄰苯三酚自氧化法。分別移取不同質(zhì)量濃度總黃酮的荔枝殼提取液1.0 mL置于10 mL試管中，加入5.00 mL濃度為0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH8.2），充分混勻，在37℃恒溫水浴10 min，取出后立即加入1 mL濃度為3.5 mmol/L的鄰苯三酚溶液，迅速搖勻，再在37℃恒溫水浴6 min，取出后加入1.0 mL濃度為8 mmol/L的HCl溶液終止反應(yīng)，在320 nm測吸樣品吸光度AC，用蒸餾水代替不同總黃酮質(zhì)量濃度的荔枝殼乙醇提取液按上述步驟測定空白對照的吸光度A0。同時用VC和BHT代替樣品，按上述步驟，測定不同濃度VC和BHT陽性對照的吸光度。超氧陰離子自由基清除率由公式（3）計算而得。

式中：A0為空白對照的吸光值；AC為樣品或陽性對照品的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對荔枝殼總黃酮得率的影響

料液比對荔枝殼總黃酮得率的影響見圖1。

圖1 料液比對荔枝殼總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of solid-to-solvent ratio on the extraction yield of total flavonoids from litchi shell

由圖 1可知，料液比在 1∶10（g/mL）～1∶20（g/mL），荔枝殼總黃酮得率逐漸增加，繼續(xù)增加溶劑量，荔枝殼總黃酮得率基本不變。這是由于增加溶劑可以增加荔枝殼細(xì)胞壁內(nèi)外總黃酮的濃度差，有利于荔枝殼中總黃酮向乙醇溶液中轉(zhuǎn)移。當(dāng)進一步增加溶劑時，總黃酮在后處理濃縮過程中的損失增加，而導(dǎo)致總黃酮得率下降[22]。綜合考慮，選擇料液比1∶20（g/mL）進行后續(xù)試驗。

2.1.2 提取溫度對荔枝殼總黃酮得率的影響

提取溫度對荔枝殼總黃酮得率的影響見圖2。

由圖2可知，溫度為50℃時，荔枝殼總黃酮得率達(dá)到最大值為5.79%，繼續(xù)升高溫度，荔枝殼總黃酮得率略有下降。這是由于隨著提取溫度的升高（低于50℃），有助于增強乙醇對總黃酮的溶解能力，但當(dāng)溫度過高（高于50℃）時，提取的總黃酮會發(fā)生氧化而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[23]，導(dǎo)致總黃酮得率下降。故選擇提取溫度50℃進行后續(xù)試驗。

圖2 提取溫度對荔枝殼總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction yield of total flavonoids from litchi shell

2.1.3 提取時間對荔枝殼總黃酮得率的影響

提取時間對荔枝殼總黃酮得率的影響見圖3。

圖3 提取時間對荔枝殼總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of total flavonoids from litchi shell

由圖3可以看出，提取時間為50 min～120 min時，總黃酮得率逐漸上升，提取時間繼續(xù)延長時（大于120 min），總黃酮得率逐漸下降。這是由于隨著提取時間增加，提取液中總黃酮物質(zhì)不斷增加，但過長時間的加熱提取可能使部分黃酮結(jié)構(gòu)被破壞或發(fā)生其它副反應(yīng)，進而導(dǎo)致總黃酮得率下降，這與文獻[24]麻瘋樹籽總黃酮提取結(jié)果較一致。因此，選擇提取時間120 min進行后續(xù)試驗。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對荔枝殼總黃酮得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對荔枝殼總黃酮得率的影響見圖4。

由圖4可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)對荔枝殼總黃酮得率有較為明顯的影響。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加至60%時，總黃酮得率達(dá)到最大值為6.84%，但當(dāng)繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)時，總黃酮得率卻不斷下降。這可能是黃酮的溶解能力與溶劑的極性有關(guān)，溶劑的極性過大或過小都會導(dǎo)致荔枝殼總黃酮的溶解能力下降[25]，故總黃酮得率下降。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%進行后續(xù)試驗。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對荔枝殼總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids from litchi shell

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化荔枝殼總黃酮提取工藝

2.2.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

響應(yīng)面優(yōu)化荔枝殼總黃酮提取試驗結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面法試驗方案和結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design arrangement and experimental results

運用Design-Expert 7.0.0軟件對數(shù)據(jù)進行回歸擬合，求得荔枝殼總黃酮得率（Y）與料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）的方程為：Y=6.71-9.167×10-3A+0.36B+0.10C-0.31D+0.11AB-0.077AC-0.67AD-0.15BC+0.80BD+0.37CD-0.38A2-0.075B2-0.26C2-0.97D2。

回歸模型分析見表3。

表3 回歸模型分析Table 3 The analysis results for regression model

從表3回歸方程分析結(jié)果可知：該回歸模型F=6.29，p=0.000 7<0.01，表明該試驗所得的回歸方程達(dá)到極顯著水平，說明該模型具有較高的可信度，回歸方程可以很好地對荔枝殼總黃酮得率進行預(yù)測。

從表3回歸模型分析結(jié)果還可以看出，B的影響極顯著，D的影響顯著，由F值可知，各因素對荔枝殼總黃酮得率的影響大小順序依次為B（提取溫度）>D（乙醇體積分?jǐn)?shù)）>C（提取時間）>A（料液比）；交互項AD和BD影響極顯著，即料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對荔枝殼總黃酮得率有極顯著影響。

2.2.2 最佳工藝的預(yù)測和驗證

用Design-Expert 7.0.0軟件分析得到荔枝殼總黃酮最佳提取條件為：料液比1∶19（g/mL）、提取溫度65℃，提取時間127 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)67.2%。在此條件下，荔枝殼總黃酮得率理論值為7.07%。實際操作過程中將提取條件修正為料液比1∶19（g/mL）、提取溫度65℃，提取時間127 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)67%，實際測定的總黃酮得率為7.03%，與模型預(yù)測值相對誤差為0.57%，說明回歸模型對荔枝殼總黃酮得率預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3 荔枝殼總黃酮抗氧化性分析

2.3.1 荔枝殼總黃酮對DPPH·的清除作用

荔枝殼總黃酮對DPPH·的清除作用見圖5。

圖5 荔枝殼總黃酮粗提液對DPPH·清除率Fig.5 Scavenging rate of total flavonoids from litchi shell on DPPH radicals

如圖5所示，當(dāng)荔枝殼總黃酮提取液質(zhì)量濃度不斷增加時，其對DPPH·的清除率也逐漸增加，當(dāng)總黃酮提取液質(zhì)量濃度為0.004 mg/mL時，DPPH·的清除率高達(dá)89%；對照品VC和BHT的質(zhì)量濃度對DPPH·的清除率大小變化趨勢與荔枝殼中總黃酮提取液的一致，當(dāng)VC和BHT質(zhì)量濃度均為0.032 mg/mL時，DPPH·的清除率分別為95%和71%。通過計算可知荔枝殼總黃酮提取液、VC和BHT對DPPH·的清除率與其質(zhì)量濃度密切相關(guān)，其半抑制濃度（IC50）分別為0.002、0.014、0.025 mg/mL，比較總黃酮提取液、VC和BHT的IC50可知，對DPPH·的清除能力強弱順序為：荔枝殼總黃酮提取液>VC>BHT，這說明荔枝殼總黃酮提取液對DPPH·有較強的清除能力。

2.3.2 荔枝殼總黃酮還原力

荔枝殼總黃酮還原力見圖6。

從圖6可以看出，隨著荔枝殼總黃酮、對照品VC和BHT溶液質(zhì)量濃度的增加，其顯色溶液的吸光度均不斷升高，且吸光度值和樣品的還原力呈正線性相關(guān)[26]。在0.04 mg/mL～0.09 mg/mL濃度范圍內(nèi)，將樣品質(zhì)量濃度（X）和還原力Y進行擬合，荔枝殼總黃酮、VC和BHT的擬合方程為Y=12.20X+0.644（R2=0.975）、Y=6.157X+0.085（R2=0.969）和 Y=4.966X+0.065（R2=0.997），說明荔枝殼總黃酮、對照品VC和BHT質(zhì)量濃度和其還原力之間均存在劑量依賴關(guān)系，且荔枝殼總黃酮還原力>VC還原力>BHT還原力。

圖6 荔枝殼總黃酮提取液的還原力Fig.6 Reduction power of total flavonids from litchi shell

2.3.3 荔枝殼總黃酮對亞硝酸鹽的清除作用

荔枝殼總黃酮對亞硝酸鹽的清除作用見圖7。

圖7 荔枝殼總黃酮粗提液對亞硝酸鹽的清除率Fig.7 Scavenging rate of total flavonoids from litchi shell on nitrite

由圖7可知，隨著荔枝殼總黃酮提取液、對照品VC和BHT質(zhì)量濃度的增加，其對亞硝酸鹽的清除率均先增加后再趨于平穩(wěn)；質(zhì)量濃度在0.1 mg/mL～8 mg/mL范圍內(nèi)，對清除能力大小順序為：荔枝殼總黃酮>BHT>VC；隨著質(zhì)量濃度濃度的升高，VC對亞硝酸鹽的清除效果越來越明顯，在之后的16 mg/mL～48 mg/mL范圍內(nèi)，對亞硝酸鹽清除能力大小順序為：VC>荔枝殼總黃酮>BHT。當(dāng)質(zhì)量濃度為48 mg/mL時，荔枝殼總黃酮提取液、VC和BHT對亞硝酸鹽的清除率分別為89%、92%和79%。說明荔枝殼總黃酮提取物對亞硝酸鹽具有較強的清除能力。

2.3.4 荔枝殼總黃酮對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用

荔枝殼總黃酮對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用見圖8。

圖8 荔枝殼總黃酮粗提液對O2-·清除率Fig.8 Scavenging rate of total flavonoids from litchi shell on superoxide anion radicals

在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，荔枝殼總黃酮提取物對O2-·清除能力隨著濃度增加而逐漸增強至平穩(wěn)；其對O2-·清除率均高于同質(zhì)量濃度的VC和BHT；當(dāng)荔枝殼總黃酮提取物質(zhì)量濃度為80 mg/L時，其清除率達(dá)到62%，表明荔枝殼總黃酮提取物對O2-·有較好的清除能力。

3 結(jié)論

乙醇提取荔枝殼總黃酮的最優(yōu)提取工藝條件為料液比1∶19（g/mL）、提取溫度65℃，提取時間 127min，乙醇體積分?jǐn)?shù)67%，實際測定的總黃酮得率為7.03%，與模型預(yù)測值相對誤差為0.57%。

荔枝殼總黃酮提取物具有較強的DPPH·、NO2-和O2-·清除能力，且在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，荔枝殼總黃酮提取物對DPPH·和O2-·的清除能力均強于對照品VC和BHT。此外，荔枝殼總黃酮提取物的還原力也強于DPPH·和O2-·。因此，荔枝殼具有較強的抗氧化能力。