響應(yīng)面優(yōu)化提取山茱萸籽油及其對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)大鼠生理生化指標(biāo)的影響

貢新燁，蔡協(xié)清

（南京工業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 211816）

山茱萸屬于山茱萸科山茱萸屬植物，在我國(guó)有著悠久的種植歷史[1]，主產(chǎn)于山西、陜西、山東、江蘇、浙江等省份[2]。山茱萸作為我國(guó)名貴木本藥材之一，通常以干燥成熟果肉入藥，其富含多種營(yíng)養(yǎng)成分[3]，包括碳水化合物、維生素C，檸檬酸、黃酮類(lèi)化合物、熊果苷等成分。山茱萸籽約占整個(gè)果實(shí)質(zhì)量的80%，是其果肉藥物化利用后的主要廢棄部分[4-5]。因此，對(duì)山茱萸籽資源的研究有利于提高山茱萸的綜合利用價(jià)值。

山茱萸籽油中富含多種不飽和脂肪酸，其中油酸含量大約為35.8%，亞油酸含量大約為34.6%[6]。攝入不飽和脂肪酸對(duì)于人體的健康有至關(guān)重要的作用，其中亞油酸是人體自身無(wú)法合成的必需脂肪酸，主要的功能是軟化血管，并在新陳代謝過(guò)程中起著重要的作用，亞油酸可以降低機(jī)體的血脂血壓，起到預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和心腦血管疾病等功效[7]。另外，山茱萸籽油中還含有多酚類(lèi)成分，其具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)自由基有較好的清除作用。鑒于山茱萸籽油具有良好的利用價(jià)值，本文將采用微波輔助溶劑法來(lái)制備山茱萸籽油，并研究其對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)大鼠生理生化指標(biāo)變化的干預(yù)影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山茱萸籽：定遠(yuǎn)縣琪榮農(nóng)林種養(yǎng)經(jīng)營(yíng)部；石油醚（30℃～60℃）、無(wú)水乙醇、正己烷、丙酮（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；血糖試劑盒、甘油三酯試劑盒、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、肌酸激酶（creatine kinase，CK）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶[glutamic-oxal（o）acetic transaminase，GOT]試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）試劑盒：南京建成生物工程所。

SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠：40只，體重在（150±5）g，浙江普康生物技術(shù)股份有限公司，SYXK（浙）2019-0032。

1.2 儀器與設(shè)備

XL-500型粉碎機(jī)：南京耀天干燥設(shè)備有限公司；MKX-E1A型微波萃取儀：青島邁威微波化學(xué)設(shè)備有限公司；J-SKY型分析天平：巨鼎天衡（蘇州）稱(chēng)重設(shè)備有限公司；DHG-9055A型鼓風(fēng)干燥機(jī)：金壇區(qū)金城致杰實(shí)驗(yàn)儀器廠；TG16-WS型高速離心機(jī)：常州金壇良友儀器有限公司；HH-s6型恒溫水浴鍋：濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山茱萸籽油的提取

提取工藝流程如下[9-10]。

挑選山茱萸籽→干燥→粉碎→加入提取溶劑→微波輔助→減壓蒸餾→干燥至恒重

挑選無(wú)蟲(chóng)蛀山茱萸籽，45℃干燥3 h，去除水分，粉碎至60目，得到山茱萸籽粉末。稱(chēng)取適量的山茱萸籽粉末，放置于錐形瓶中，加入一定液料比的提取溶劑，放置于微波萃取儀中，在不同的微波功率、提取溫度、提取時(shí)間下進(jìn)行提取，提取結(jié)束后，蒸餾出溶劑，并在45℃下干燥至恒重得到山茱萸籽油。

Y/%=（M1-M2/m）×100

式中：Y為山茱萸籽油得率，%；M1為山茱萸籽油質(zhì)量，g；M2為錐形瓶質(zhì)量，g；m為山茱萸籽粉末質(zhì)量，g。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

固定提取溫度40℃、提取時(shí)間50 min、微波功率300 W，設(shè)定不同液料比 4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1（mL/g）；固定提取時(shí)間 50 min、微波功率 300 W、液料比 8∶1（mL/g），設(shè)定不同提取溫度 30、35、40、45、50℃；固定提取溫度40℃、液料比8∶1（mL/g）、微波功率300 W，設(shè)定不同提取時(shí)間 30、40、50、60、70 min；固定提取溫度40℃、液料比8∶1（mL/g）、提取時(shí)間50 min，設(shè)定不同微波功率 100、200、300、400、500 W，研究各因素對(duì)山茱萸籽油得率的影響。

1.3.3 動(dòng)物分組及運(yùn)動(dòng)方案

選取SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體重（150±5）g，大鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度（23±2）℃。隨機(jī)分成2組，每組20只大鼠，分成對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。大鼠空腹過(guò)夜后，將大鼠放入到游泳池內(nèi)，大鼠的尾部負(fù)重其體重5%的鉛絲，從大鼠進(jìn)入到游泳池開(kāi)始，到大鼠力竭（頭部沉入水中8 s不能浮出）的這段周期記為游泳時(shí)間[11]。實(shí)驗(yàn)組游泳前，20只大鼠灌胃10 mg/g山茱萸籽油，游泳力竭后，20只大鼠再次灌胃10 mg/g山茱萸籽油（灌胃劑量參照程耀明的小鼠實(shí)驗(yàn)方法并加以改進(jìn)[12]）；對(duì)照組20只大鼠游泳前后各灌胃蒸餾水10mg/g，試驗(yàn)時(shí)間持續(xù)6周。游泳前和游泳2 h后，采取眼眶血，離心取血漿，并對(duì)血糖、甘油三酯、血尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、肌酸激酶（CK）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT）等指標(biāo)根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本文使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，采取組間進(jìn)行對(duì)比，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑對(duì)山茱萸籽油得率的影響

以山茱萸籽油得率為考察指標(biāo)，考察4種提取溶劑對(duì)山茱萸籽油得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 提取溶劑對(duì)山茱萸籽油得率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on yield of Cornus officinalis seed oil

從圖1可知，正己烷相比于其它3種溶劑對(duì)山茱萸籽油得率的影響最大，所以選擇正己烷作為提取溶劑進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[13]。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 液料比對(duì)山茱萸籽油得率的影響

液料比對(duì)山茱萸籽油得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 液料比對(duì)山茱萸籽油得率的影響Fig.2 Effect of liquid to material ratio on the yield of Cornus officinalis seed oil

由圖2可知，隨著液料比的增加，山茱萸籽油得率逐漸提高，當(dāng)液料比為10∶1(mL/g）時(shí)，得率達(dá)到最高。這是由于液料比的增加使得物料與溶劑之間接觸更充分，有利于油脂的提取，繼續(xù)增大液料比，會(huì)使得油脂與提取溶劑之間分離時(shí)間變長(zhǎng)，成本上升，同時(shí)溶劑量增加會(huì)使得山茱萸籽內(nèi)多余成分析出，影響得率[14]，故選擇液料比為 10∶1(mL/g）。

2.2.2 提取溫度對(duì)山茱萸籽油得率的影響

提取溫度對(duì)山茱萸籽油得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)山茱萸籽油得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of Cornus officinalis seed oil

由圖3可知，隨著提取溫度的增加，山茱萸籽油得率逐漸升高，當(dāng)提取溫度升高到40℃時(shí)，得率達(dá)到最高，繼續(xù)提高溫度，得率出現(xiàn)降低趨勢(shì)。這是因?yàn)闇囟鹊纳?，使得油脂易析出到溶劑中，而溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致溶劑揮發(fā)，造成得率降低[15]，故選擇提取溫度為40℃。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)山茱萸籽油得率的影響

提取時(shí)間對(duì)山茱萸籽油得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)山茱萸籽油得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on yield of Cornus officinalis seed oil

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的增加，山茱萸籽油得率逐漸升高，在提取時(shí)間為60 min時(shí)達(dá)到最高，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，得率不再升高。因此，選擇提取時(shí)間為60min。

2.2.4 微波功率對(duì)山茱萸籽油得率的影響

微波功率對(duì)山茱萸籽油得率的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，隨著微波功率的加強(qiáng)，山茱萸籽油得率逐漸升高，在微波功率為400 W時(shí)達(dá)到最高，繼續(xù)加強(qiáng)微波功率，得率出現(xiàn)降低趨勢(shì)。微波功率的加強(qiáng)，可以使山茱萸籽內(nèi)的細(xì)胞破碎速度加快，進(jìn)而使油脂更容易析出到溶劑中，繼續(xù)增加微波功率會(huì)使得溶劑揮發(fā)加劇，導(dǎo)致溶劑流失，得率降低[16]。因此，選擇微波功率為400 W。

圖5 微波功率對(duì)山茱萸籽油得率的影響Fig.5 Effect of microwave power on yield of Cornus officinalis seed oil

2.3 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以山茱萸籽油得率（Y）為指標(biāo)，選擇液料比（X1）、提取溫度（X2）、微波功率（X3）為因素，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Box Behnken design factor level

響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box Behnken experimental design and results

利用Design-Expert軟件對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到微波輔助溶劑法提取山茱萸籽油的多元回歸方程：Y=31.18+0.47X1+0.59X2+0.13X3+0.070X1X2-0.16X1X3-0.31X2X3-0.96X12-1.02X22-1.57X32。

由表3可知，模型P<0.01（極顯著），失擬項(xiàng)P值為0.150 5（不顯著），因變量與所有自變量之間的線性關(guān)系顯著R2=0.997 5，R2Adj=0.994 3，說(shuō)明該方程的擬合度較好，表明回歸模型達(dá)到極顯著，可以反映得率和各因素之間的關(guān)系，試驗(yàn)誤差小，試驗(yàn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)具有良好的可靠性，故可以用該模型對(duì)山茱萸籽油的提取試驗(yàn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

表3 響應(yīng)面回歸模型ANOVA分析結(jié)果Table 3 ANOVA analysis results of response surface regression model

從各個(gè)因素的顯著性水平差異可知，液料比、提取溫度、微波功率影響為極顯著，對(duì)山茱萸籽油得率影響順序?yàn)?，提取溫度＞液料比＞微波功率，X1X3達(dá)到顯著水平（P<0.05）、X2X3達(dá)到極顯著水平（P<0.01），并且各個(gè)因素的二次項(xiàng)對(duì)山茱萸籽油得率的影響均達(dá)到了極顯著水平（P<0.01）。

試驗(yàn)得出山茱萸籽油最佳提取條件為：液料比10.51∶1（mL/g）、提取溫度41.49℃、微波功率 399.79W，在此條件下山茱萸籽油的得率為31.33%。根據(jù)試驗(yàn)的可操作性，將試驗(yàn)條件調(diào)整為液料比11∶1（mL/g）、提取溫度41℃、微波功率400 W，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得出山茱萸籽油平均得率為31.25%，與預(yù)測(cè)值相近。因此，響應(yīng)面法優(yōu)化得到的山茱萸籽油工藝條件準(zhǔn)確可靠。

2.4 山茱萸籽油對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)大鼠游泳時(shí)間的影響

山茱萸籽油對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)大鼠游泳時(shí)間的影響見(jiàn)圖6。

由圖6可知，實(shí)驗(yàn)組大鼠游泳時(shí)間顯著大于對(duì)照組大鼠，表明山茱萸籽油具有明顯的延長(zhǎng)游泳時(shí)間的作用，能夠提高大鼠的耐力，緩解疲勞[17]。

圖6 山茱萸籽油對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)大鼠游泳時(shí)間的影響Fig.6 Effect of Cornus officinalis seed oil on swimming time of swimming rats

2.5 山茱萸籽油對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)大鼠血液生理生化指標(biāo)變化的干預(yù)影響

山茱萸籽油對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)大鼠血液生理生化指標(biāo)變化的干預(yù)影響見(jiàn)表4。

表4 山茱萸籽油對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)大鼠血液生理生化指標(biāo)變化的干預(yù)影響Table 4 Intervention effect of Cornus officinalis seed oil on blood physiological and biochemical index changes of swimming rats

從表4得出，游泳前2組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。對(duì)照組大鼠游泳后血糖、甘油三酯、GSH-Px、SOD水平明顯下降（P<0.05），對(duì)照組大鼠游泳后 BUN、MDA、CK、GOT、GPT水平明顯升高（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組大鼠游泳后與對(duì)照組大鼠游泳后相比，血糖、甘油三酯、GSH-Px、SOD水平呈升高趨勢(shì)（P<0.05），BUN、MDA、CK、GOT、GPT 水平呈降低趨勢(shì)（P<0.05）。說(shuō)明大鼠經(jīng)過(guò)游泳力竭運(yùn)動(dòng)之后體內(nèi)肝臟、肌肉等臟器組織代謝加快，代謝產(chǎn)物堆積，體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，這些機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞具有嚴(yán)重的損傷作用[18-20]。而游泳后實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)過(guò)灌胃山茱萸籽油，各項(xiàng)指標(biāo)均明顯優(yōu)于灌胃蒸餾水的對(duì)照組，山茱萸籽油由于含有多酚類(lèi)成分，其具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)自由基有較好的清除作用，同時(shí)山茱萸籽油中富含多種不飽和脂肪酸，可以起到促進(jìn)體內(nèi)脂肪分解的作用，并且可以降低機(jī)體的血脂，起到對(duì)大鼠生理生化指標(biāo)變化的干預(yù)作用。

3 結(jié)論

采用微波輔助溶劑法提取制備山茱萸籽油，得出最佳提取條件為：液料比11∶1（mL/g）、提取溫度41℃、微波功率400 W。大鼠游泳運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)照組大鼠游泳后血糖、甘油三酯、GSH-Px、SOD水平明顯下降（P<0.05），對(duì)照組大鼠游泳后 BUN、MDA、CK、GOT、GPT水平明顯升高（P<0.05），同時(shí)灌胃山茱萸籽油的實(shí)驗(yàn)組大鼠游泳后與對(duì)照組大鼠游泳后相比血糖、甘油三酯、GSH-Px、SOD 水平呈升高趨勢(shì)（P<0.05），BUN、MDA、CK、GOT、GPT 水平呈顯著降低趨勢(shì)（P<0.05），試驗(yàn)組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)均明顯優(yōu)于灌胃蒸餾水的對(duì)照組，起到對(duì)大鼠生理生化指標(biāo)變化的干預(yù)作用。另外，山茱萸籽油具有明顯延長(zhǎng)游泳時(shí)間的作用，提高大鼠的耐力，緩解疲勞。